Lesson 15 of 20

포르말린 고정 — 메틸렌 다리로 시간을 멈춘다

SI 「Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE)」

조직을 떼어 내면 곧바로 스스로를 분해하기 시작합니다. 효소가 풀려나오고 세균이 자라요. 그래서 고정합니다.

단백질−NH₂ + HCHO + H₂N−단백질 → 단백질−N−CH₂−N−단백질

포름알데하이드가 아미노기 둘 사이에 끼어 메틸렌 다리를 놓습니다. 단백질끼리 묶여 그물이 되고, 그 자리에서 굳어요.

High school고정이 하는 일과 대가

얻는 것	잃는 것
구조가 보존됨	단백질이 변형됨 — 항체가 못 알아볼 수 있음
효소 활성 정지	효소 실험 불가
상온에서 수십 년 보관	DNA·RNA가 부서지고 변형됨
얇게 썰 수 있음	—

세 번째 줄이 분자 실험의 골칫거리입니다 — FFPE 시료의 핵산은 짧고 손상돼 있습니다.

고정의 대가 셋

🫥

항원이 가려진다

다리가 항체가 알아볼 자리를 덮습니다 → 항원 되살리기(열·pH)가 필요해집니다.

✂️

RNA 가 끊긴다

고정과 보관 중에 잘게 부서집니다 → DV200 을 재는 이유(/chem 8강).

🧊

되돌리기 어렵다

오래 고정할수록 다리가 많아져 풀기 힘듭니다.

High school왜 파라핀에 넣나

고정만으로는 조직을 얇게 썰 수 없습니다. 물렁하니까요. 그래서 파라핀(양초 성분)으로 채워 굳힙니다.

단계	하는 일
고정	포르말린
탈수	에탄올 농도를 올려 가며 물을 뺌
투명화	자일렌 — 에탄올과 파라핀 둘 다와 섞임
침투	녹인 파라핀이 조직에 스며듦
포매	굳혀서 블록을 만듦

에탄올과 파라핀은 안 섞입니다 — 그래서 자일렌이라는 중개자가 필요합니다.

16강의 "극성 사다리"가 이것입니다. 물 → 에탄올 → 자일렌 → 파라핀으로 갈수록 극성이 낮아져요. 한 칸씩 건너야 합니다.

곡선은 <b>모의</b>입니다. 논문에는 고정 시간이 적혀 있지 않아요.

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# 고정 시간과 그 대가 (경향을 보는 모의)
import numpy as np

시간 = [0, 6, 12, 24, 48, 96]      # 시간
print(f"{'고정(h)':>8}{'조직 보존':>10}{'항원 남음':>10}{'RNA 성함':>10}   판정")
for t in 시간:
    보존 = 100 * (1 - np.exp(-t / 6))
    항원 = 100 * np.exp(-t / 40)
    rna  = 100 * np.exp(-t / 30)
    if t == 0:      판정 = "썩기 시작한다"
    elif t < 24:    판정 = "권장 구간"
    else:           판정 = "과고정 — 되살리기 어렵다"
    print(f"{t:>8}{보존:>9.0f}%{항원:>9.0f}%{rna:>9.0f}%   {판정}")
print()
print("보통 12~24시간을 쓴다. 논문은 시간을 적지 않았다 — 표준 절차를 따랐다는 뜻이다.")

High school항원 부활

고정이 단백질을 굳혀 놓으면, 항체가 붙을 자리(항원)가 가려집니다. 그래서 염색 전에 되살려야 해요.

방법	내용
열 유도 (HIER)	완충액에 담가 고온 — 가장 흔함
효소 유도	프로테아제로 부분 소화

메틸렌 다리를 일부 끊어 항원을 노출시킵니다 — 너무 세면 조직이 부서집니다.

완충액 pH와 시간이 항체마다 다릅니다. 그래서 항체 설명서에 "citrate pH 6.0, 20분" 같은 조건이 적혀 있어요.

🤔 Check yourself

FFPE 조직에서 항원 되살리기(antigen retrieval)가 필요한 이유는?