2강 / 20강

유전자를 끄고, 세포를 한 개씩 읽는다

Dixit A, et al. Cell 167:1853-1866 (2016) · Perturb-seq

/wrn 강의의 CRISPR 스크린은 살았나 죽었나만 셌습니다. 안내 RNA 가 통에서 사라졌는지 남았는지요. 그것으로 '이 유전자가 필요한가' 는 알 수 있지만 왜 필요한가는 알 수 없습니다.

Perturb-seq 는 거기에 한 겹을 더합니다. 죽었는지만 보는 대신, 살아 있는 세포 하나하나에서 유전자 2만 개가 각각 얼마나 켜져 있는지를 읽습니다.

고등학생끄고, 한 개씩 읽는다

Perturb-seq은 두 기술을 합친 것입니다. 이름도 그 둘을 붙인 거예요.

부분	하는 일
Perturb (섭동)	CRISPR로 유전자를 끈다
seq (단일세포 RNA 시퀀싱)	세포 하나하나의 유전자 발현을 읽는다

따로 하면 이렇게 됩니다 — 유전자를 하나 끄고, 세포를 통째로 갈아 평균 발현을 잽니다. 유전자 1만 개를 다 하려면 실험을 1만 번 해야 해요.

Perturb-seq은 한 통에 다 섞어 넣고, 나중에 세포마다 "너는 뭐가 꺼졌니?"를 물어봅니다.

보통 CRISPR 스크린

세포당 정보 1비트
살았다 / 죽었다
→ "필요한가?"

Perturb-seq

세포당 정보 2만 개
전사체 전부
→ "무엇이 바뀌었나?"

죽지 않는 표적도 볼 수 있게 됩니다. 세포를 안 죽이면서 상태를 바꾸는 유전자들 말입니다 — 면역·염증·분화처럼 신약에서 중요한 것 대부분이 여기 있습니다.

고등학생어떻게 섞어 놓고 구분하나

비결은 가이드 RNA가 바코드 역할을 한다는 것입니다.

단계	일어나는 일
1	유전자 1만 개를 겨냥하는 가이드 RNA 라이브러리를 만든다
2	세포 수백만 개에 세포당 하나씩 들어가게 감염시킨다
3	각 세포에서 그 유전자가 꺼진다
4	단일세포 시퀀싱으로 세포마다 RNA를 읽는다
5	읽은 RNA 중에 가이드 RNA 서열도 들어 있다 — 어느 유전자를 껐는지 알 수 있다

5단계가 핵심입니다. 세포 안에 "나는 WRN을 껐다"는 쪽지가 같이 들어 있는 셈이에요. 그래서 섞어 놓고도 나중에 분류할 수 있습니다.

왼쪽 칸이 '무엇을 껐는지', 오른쪽이 '무엇이 켜져 있는지'입니다. ACTB·GAPDH 같은 살림 유전자는 안 흔들리는 것도 보이죠.

Python 브라우저에서 실행

# 세포 하나에서 나오는 것을 아주 작게 흉내 냅니다.
import numpy as np

rng = np.random.default_rng(3)
genes = ["IL2", "IFNG", "CD69", "TNF", "ACTB", "GAPDH"]

def read_cell(target, effect):
    base = np.array([40, 35, 60, 25, 900, 800])       # 평소 발현량
    hit = np.array([effect, effect, effect, effect, 0, 0])   # 표적이 누르는 것들
    return np.maximum(rng.poisson(base * (1 + hit)), 0)

print("세포   껐던 것    ", "  ".join(g.rjust(5) for g in genes))
for i, (tgt, eff) in enumerate([("대조", 0.0), ("대조", 0.0), ("LAT", -0.8), ("LAT", -0.8)], 1):
    counts = read_cell(tgt, eff)
    print(str(i).rjust(3), tgt.ljust(9), "  ".join(str(c).rjust(5) for c in counts))

고등학생세포당 하나씩이 왜 중요한가

한 세포에 가이드가 두 개 들어가면 어떻게 될까요. 두 유전자가 동시에 꺼지고, 관찰된 변화가 어느 쪽 탓인지 알 수 없습니다.

감염 농도를 낮게 잡아 대부분의 세포가 0개 또는 1개를 받게 합니다 (MOI를 낮춤)

감염 농도	결과
너무 낮음	대부분의 세포가 아무것도 안 받음 — 낭비
적절	대부분 1개 — 해석 가능
너무 높음	2개 이상이 많음 — 해석 불가

보통 감염된 세포의 비율을 20~30%로 맞춥니다. 포아송 분포를 생각하면, 그 정도면 감염된 세포 중 2개 이상 받은 비율이 낮게 유지돼요.

이 방식으로 얻은 것이 이 강의가 쓰는 자료입니다. 사람 1차 CD4+ T세포에서 유전자 11,526개를 하나씩 끄고, 그때마다 전사체 전부를 읽었습니다.

이 다섯 줄이 자료의 크기 전부입니다. 다음 강부터 하나씩 뜯습니다.

Python 브라우저에서 실행

import pseq

s = pseq.stats()
print("유전자      ", s["total_genes"])
print("클러스터    ", s["total_clusters"])
print("배양 조건   ", ", ".join(s["conditions"]))
print("검사한 질환 ", len(s["diseases_tested"]), "종")
print("유의한 연관 ", s["significant_associations"], "건")

고등학생무엇을 얻는가 — 표의 모양

실험이 끝나면 이런 표가 나옵니다.

세포 ID	꺼진 유전자	조건	유전자1 발현	유전자2 …
cell_001	WRN	Rest	3	…
cell_002	WRN	Stim8hr	0	…
cell_003	대조군	Rest	5	…

행이 세포 수십만~수백만 개, 열이 유전자 2만 개입니다. 여기서 "WRN을 끈 세포들"과 "대조군 세포들"을 모아 비교하면, WRN을 껐을 때 무엇이 달라지는지 알 수 있어요.

한 번의 실험에서 유전자 수만큼의 실험 결과가 나옵니다 — 그것이 이 방법의 힘입니다.

🤔 확인 문제

Perturb-seq 가 보통 CRISPR 스크린보다 더 볼 수 있는 것은?

🤔 확인 문제

한 세포에서 '무엇을 껐는지' 와 '무엇이 켜져 있는지' 를 함께 알 수 있는 이유는?