Lesson 5 of 20

똑같은 read 가 자꾸 나온다 — 중복 37%

PCR 중복인가 진짜 발현인가 · RNA-seq 에서 중복을 지우면 안 되는 이유

같은 서열을 가진 read 가 몇 번이나 나오는지 세어 봅시다. FastQC 와 같은 방식으로, 앞 50 글자만 보고 셉니다.

High school똑같은 read 가 37%

read 를 서열 그대로 비교해 보면, 이 자료의 37% 가 다른 read 와 완전히 같은 서열이다. 이걸 중복(duplicate)이라 한다.

중복은 두 가지 원인에서 온다

원인	정체	버려야 하나
PCR 중복	같은 분자 하나를 여러 번 복사	정보가 아님 — 버리는 게 맞음
진짜 발현	서로 다른 분자가 우연히 같은 서열	버리면 안 됨 — 이게 신호다

문제는 둘을 구별할 수 없다 는 것이다. 파일에 남은 것은 글자뿐이고, 두 경우 모두 글자가 똑같다.

같은 관찰, 두 원인. 자료만으로는 못 가른다

20,000 read 로도 같은 그림이 나옵니다. 위젯은 150만 read 로 잰 값을 보여 줍니다.

Python Runs in your browser

import bu
from collections import Counter

c = Counter(s[:50] for _, s, _q in bu.reads("WT_1"))
n = sum(c.values())
uniq = len(c)

print(f"read        : {n:,}")
print(f"고유 서열   : {uniq:,}")
print(f"중복 비율   : {(1 - uniq/n)*100:.2f} %")
print()
print("몇 번 나왔나별로 세면")
by = Counter(c.values())
for k in sorted(by)[:8]:
    print(f"  {k:>3}번 나온 서열 {by[k]:>6,}개")
print()
print("── 가장 많이 나온 서열 5개 ──")
for s, k in c.most_common(5):
    print(f"  {k:>4}번 ({k/n*100:.3f}%)  {s}")

중복은 두 얼굴이다

나쁜 중복 — PCR 산물

라이브러리를 만들 때 PCR 로 늘립니다. 원본 분자 하나가 수십 벌로 복사되면, 시퀀서는 그것을 수십 개의 서로 다른 분자로 착각해 셉니다.

가짜로 부풀린 발현

좋은 중복 — 진짜로 많은 것

Actb 처럼 어마어마하게 발현되는 유전자는, 원본 분자가 정말 많아서 같은 자리에서 시작하는 조각이 여러 개 생깁니다.

진짜 발현

서열만 보고는 둘을 구별할 수 없습니다.

그래서 RNA-seq 에서는 중복을 지우지 않는 것이 표준입니다. 지우면 고발현 유전자가 통째로 깎여 나가거든요. DNA 시퀀싱(WGS·WES)에서는 반대로 반드시 지웁니다 — 게놈의 한 자리에서 조각이 여러 개 나올 이유가 없으니까요.

High schoolRNA-seq 에서 중복을 지우면 안 되는 이유

유전체 시퀀싱(DNA-seq)에서는 중복을 지우는 것이 표준이다. RNA-seq 에서는 대개 지우지 않는다. 왜 다른가?

읽는 대상이 다르다

	DNA-seq	RNA-seq
원본 분자	유전체 두 벌 — 각 자리에 2개	전사체 — 유전자마다 수천 개
같은 서열이 여러 번	이상함 → PCR 탓	당연함 → 발현량 그 자체
중복 제거	필요	발현량을 깎아 먹음

많이 발현되는 유전자일수록 원본 분자가 많고, 그래서 같은 서열이 자주 나온다. 중복을 지우면 발현량이 높은 유전자일수록 더 많이 깎인다. 측정하려던 것을 측정 과정이 지워 버리는 셈이다.

"중복 제거" 는 보편적 좋은 습관이 아니라 실험 종류에 달린 결정이다

중복 상위 서열을 유전자에 붙여 보면 정체가 절반쯤 드러납니다.

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import bu
from collections import Counter
import matplotlib.pyplot as plt

# 중복이 많은 서열은 정말 고발현 유전자에서 왔나? 붙여 봅니다.
idx = bu.index()
c = Counter(s[:50] for _, s, _q in bu.reads("WT_1"))

print(f"{'횟수':>5}  {'붙은 유전자':<14}서열 앞 40")
print("-" * 74)
for s50, k in c.most_common(8):
    g = bu.assign(s50, idx) or "—"
    print(f"{k:>5}  {g:<14}{s50[:40]}")
print()
print("붙지 않은 것들의 정체는 6강에서 밝힙니다.")

중복률은 read 수에 딸린 값입니다. 깊이를 맞추지 않은 비교는 의미가 없습니다.

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import bu
from collections import Counter

# 함정 하나 — 중복률은 read 를 많이 볼수록 저절로 올라간다.
# WT_1 만 20,000 개를 실었으므로, 그대로 비교하면 WT_1 이 이깁니다.
print("① 있는 대로 세면 (WT_1 만 20,000, 나머지 4,000)")
for s in bu.SAMPLES:
    c = Counter(x[:50] for _, x, _q in bu.reads(s))
    n = sum(c.values())
    print(f"   {s:<6}{n:>7,} read   중복 {(1-len(c)/n)*100:>5.2f}%")

print()
print("② 모두 4,000 개로 맞추고 세면")
for s in bu.SAMPLES:
    c = Counter(x[:50] for _, x, _q in bu.reads(s, 4000))
    n = sum(c.values())
    print(f"   {s:<6}{n:>7,} read   중복 {(1-len(c)/n)*100:>5.2f}%   "
          f"{'WT' if s in bu.WT else 'KD'}")
print()
print("깊이를 맞추기 전에는 WT_1 이 유난히 높아 보였습니다 — read 를 5배 봤을 뿐인데요.")
print("맞추고 나면 WT 와 KD 의 차이가 제 크기로 드러납니다.")

🎮 중복 실험실

표본별 중복률과, 가장 많이 나온 서열들을 확인하세요.

High schoolWT 와 KD 의 중복률이 다르다

이 자료에서 두 조건의 중복률이 다르게 나온다. 이것은 그냥 넘길 관찰이 아니다.

무엇을 뜻할 수 있나

가능성	확인할 방법
라이브러리 투입 RNA 양이 달랐다	실험 기록
PCR 사이클 수가 달랐다	실험 기록
진짜로 전사체 복잡도가 다르다	KD 가 전사를 억제했다면 가능
시퀀싱 깊이가 달랐다	read 총수 비교

왜 이게 위험한가

중복률이 조건마다 다르면, 기술적 차이가 생물학적 차이로 오독될 수 있다. "KD 에서 유전자 X 가 줄었다" 는 결론이 사실은 "KD 라이브러리가 덜 복잡했다" 일 수 있다.

실험군과 대조군 사이의 기술적 차이는 언제나 먼저 배제해야 할 설명 이다. 이 습관은 /stat 에서 말하는 교란 변수와 정확히 같은 이야기다.

두 조건이 다르면, 생물학보다 기술을 먼저 의심하라

🤔 Check yourself

RNA-seq 에서 중복 read 를 지우지 않는 것이 표준인 이유는?

🤔 Check yourself

PCR 중복과 진짜 발현에 의한 중복을 서열만으로 구별할 수 없는 이유는?

🤔 Check yourself

WT 표본들의 중복률이 KD 보다 계통적으로 높다는 관찰의 함의는?