11강 / 20강

가닥 — 역상보를 잊으면 절반을 잃는다 (이 자료는 아니지만)

라이브러리가 가닥 정보를 지켰는지 자료에서 직접 알아낸다

참조 전사체는 한 가닥으로 적혀 있습니다 — mRNA 와 같은 방향(sense)이죠. 그런데 read 는 어느 가닥에서 왔는지 모릅니다.

참조 (sense) 5'-ACGTACGTTTGCAGGG-3' read 가 sense ACGTACGTTTGCA → 그대로 찾으면 있다 read 가 antisense TGCAAACGTACGT → 그대로 찾으면 없다 역상보로 뒤집으면 ACGTACGTTTGCA → 있다

그래서 안전하게 하려면 양쪽을 다 찾아봐야 합니다. 그런데 라이브러리가 가닥 특이적(stranded) 이라면 한쪽만 봐도 됩니다. 이 자료가 어느 쪽인지, 자료에게 물어봅시다.

고등학생가닥이라는 함정

DNA 는 두 가닥이다. RNA 는 그중 한 가닥을 베껴 만든다. 그런데 시퀀싱 결과 파일에는 어느 가닥이었는지 안 적혀 있을 수 있다.

가닥 정보를 잃으면 무슨 일이

read 가 유전자에 붙지 않는다. 정확히는, 뒤집어서 대보지 않으면 안 붙는다. ACGT 로 시작하는 유전자에서 나온 read 가 파일에는 ACGT 로 적힐 수도 있고, 역상보인 ACGT 의 반대 가닥으로 적힐 수도 있다.

원본	5'-ACGTTG-3'
역상보	5'-CAACGT-3'

글자만 보면 완전히 다른 서열이다. 역상보를 안 해 보면 절반을 놓친다.

서열 비교에서 역상보를 잊는 것은 가장 흔하고 가장 조용한 실수다

역상보는 뒤집고 상보로 바꾸는 것입니다. 두 번 하면 원래대로 돌아오죠.

Python 브라우저에서 실행

import bu

s = "ACGTACGTTTGCA"
print("원본  ", s)
print("역상보", bu.rc(s))
print("두 번 뒤집으면 제자리:", bu.rc(bu.rc(s)) == s)

네 갈래로 나눠 세면 라이브러리의 성격이 드러납니다.

Python 브라우저에서 실행

import bu

idx = bu.index()
K = bu.K
fwd = rev = both = none = 0

for _, s, _q in bu.reads("WT_1"):
    f = any(idx.get(s[p:p+K]) for p in range(len(s)-K+1))
    r = any(idx.get(bu.rc(s)[p:p+K]) for p in range(len(s)-K+1))
    if f and r:   both += 1
    elif f:       fwd  += 1
    elif r:       rev  += 1
    else:         none += 1

hit = fwd + rev + both
print(f"정방향만 걸림 : {fwd:>6,}")
print(f"역상보만 걸림 : {rev:>6,}")
print(f"양쪽 다       : {both:>6,}")
print(f"아무 데도     : {none:>6,}")
print()
print(f"붙은 read 중 정방향 비율 : {fwd/hit*100:.1f} %")

고등학생가닥 보존 라이브러리라는 것

실험 방법에 따라 가닥 정보가 남기도 하고 사라지기도 한다.

라이브러리	가닥 정보	흔한가
비가닥(unstranded)	없음	옛날 표준
가닥 보존(stranded)	있음	지금 표준

가닥 정보가 있으면 뭐가 좋나

유전체에는 서로 마주 보고 겹쳐 있는 유전자 가 꽤 있다. 가닥 정보가 없으면 두 유전자의 read 를 구별할 수 없다. 안티센스 전사체도 마찬가지다.

가닥 보존 라이브러리를 쓰면 이런 모호함이 사라진다. 그래서 비용이 조금 더 들어도 요즘은 거의 다 가닥 보존으로 만든다.

가닥 정보는 정보량을 늘리는 게 아니라 모호함을 없앤다

97%가 정방향입니다

붙은 read 의 97% 남짓이 참조와 같은 방향으로 걸립니다. 가닥이 무작위였다면 50 대 50 이 나왔어야 하죠.

이 라이브러리는 가닥 특이적이고, read 는 mRNA 와 같은 방향입니다.

이것을 알면 두 가지가 달라집니다.

계산이 절반 — 역상보를 안 봐도 됩니다 (우리는 안전하게 계속 봅니다)
겹친 유전자를 가릴 수 있다 — 게놈에는 앞뒤로 겹쳐 있는 유전자 쌍이 있는데, 가닥을 알면 어느 쪽 것인지 정할 수 있습니다

양쪽에 다 걸리는 read(1~2%)는 어떤 것들일까요? 서열 자체가 회문(palindrome)에 가깝거나, 반복 서열이거나, 서로 반대 방향으로 겹친 두 전사체에 걸린 경우입니다.

가닥 비율이 표본마다 다르면 키트가 섞였다는 신호입니다.

Python 브라우저에서 실행

import bu

# 표본마다 가닥 비율이 같은가 — 다르면 라이브러리 키트가 다르다는 뜻
idx = bu.index(); K = bu.K
print(f"{'표본':<7}{'정방향':>9}{'역상보':>9}{'양쪽':>8}   정방향 비율")
print("-" * 48)
for name in bu.SAMPLES:
    f = r = b = 0
    for _, s, _q in bu.reads(name, 4000):
        hf = any(idx.get(s[p:p+K]) for p in range(len(s)-K+1))
        hr = any(idx.get(bu.rc(s)[p:p+K]) for p in range(len(s)-K+1))
        if hf and hr: b += 1
        elif hf:      f += 1
        elif hr:      r += 1
    tot = f + r + b
    print(f"{name:<7}{f:>9,}{r:>9,}{b:>8,}   {f/tot*100:>8.1f} %")
print()
print("일곱 표본이 모두 같은 모양입니다 — 같은 방식으로 만든 라이브러리입니다.")

고등학생자료에서 직접 알아낸다

메타데이터를 믿지 않기로 했으니(2강), 가닥 여부도 자료에서 확인 한다. 방법은 단순하다.

단계	하는 일
1	read 를 원본 그대로 참조에 대본다 → 맞은 개수 A
2	read 의 역상보를 참조에 대본다 → 맞은 개수 B
3	A 와 B 의 비를 본다

비를 읽는 법

A : B	결론
약 50 : 50	비가닥 라이브러리
약 95 : 5	가닥 보존 — 정방향
약 5 : 95	가닥 보존 — 역방향

세 줄짜리 실험으로 실험 프로토콜을 역추적한 셈이다. 자료는 자기가 어떻게 만들어졌는지를 알고 있다.

문서를 찾지 말고 자료에게 물어라 — 대부분 자료가 답을 갖고 있다

🎮 가닥 실험실

read 를 골라 정방향·역상보 양쪽에서 찾아보세요.

고등학생가닥을 잘못 알면 생기는 일

실제	설정	결과
비가닥	가닥 보존으로 설정	발현량이 약 절반 으로 줄어듦
가닥 보존	비가닥으로 설정	겹친 유전자에서 발현량 부풀려짐
정방향	역방향으로 설정	거의 아무것도 안 붙음 — 금방 알아챔

가장 위험한 것은 첫 줄이다

세 번째 경우처럼 완전히 망가지면 오히려 안전하다. 바로 알아채니까. 첫 줄은 절반쯤 그럴듯한 결과 가 나온다. 전체 발현량이 낮아지지만 상대 비교는 대충 맞으니 "이번 시료가 좀 얕게 읽혔나 보다" 하고 넘어가기 쉽다.

조용히 틀리는 오류가 시끄럽게 틀리는 오류보다 위험하다 는 것 — 이 강의에서 여러 번 나오는 이야기다.

완전히 망가진 결과는 안전하다. 반쯤 그럴듯한 결과가 무섭다

🤔 확인 문제

붙은 read 의 97%가 참조와 같은 방향이라는 관찰이 뜻하는 것은?

🤔 확인 문제

카운팅 도구에 가닥 방향을 거꾸로 지정하면 나타나는 증상은?

🤔 확인 문제

정방향과 역상보 양쪽에 다 걸리는 read 가 생기는 이유로 알맞지 않은 것은?