18강 / 20강

진짜 파이프라인은 무엇을 더 하나

STAR · salmon · featureCounts 가 우리 여덟 줄에 더하는 것들

우리가 만든 것을 정리하면 이렇습니다.

FASTQ 읽기 → k-mer 색인 → read 마다 첫 일치 유전자에 +1 → 표

실제 파이프라인은 이 사이사이에 무엇을 더 할까요?

단계	우리	진짜 도구
참조	290 유전자 · 전사체 1개씩	전사체 14만개 전부, 또는 게놈 27억 염기
일치	정확히 맞는 31-mer	불일치·삽입·결실을 허용해 정렬
스플라이싱	없음	엑손을 건너뛰는 read 를 이어 붙인다
여러 곳에 걸림	먼저 걸린 곳	버리거나(featureCounts) 확률로 나눈다(salmon)
이형질체	구별 안 함	EM 으로 전사체별 발현을 추정
편향 보정	없음	GC · 서열 · 위치 편향을 모형으로 보정
결과	유전자 카운트	+ 정렬 좌표 · 품질 · 이형질체 비율

고등학생우리 여덟 줄과 진짜 도구의 차이

12강에서 짠 여덟 줄과 STAR·salmon·featureCounts 의 차이를 항목별로 적어 본다. 그것이 이 강의다.

먼저 같은 것부터

단계	우리	진짜 도구
참조를 색인화	k-mer 사전	FM-index · suffix array
read 를 조회	사전 조회	같은 발상, 압축됨
유전자별로 셈	카운터	같음

뼈대가 같다. 이것이 12강에서 여덟 줄을 짠 이유다. 차이는 뼈대가 아니라 예외 처리 에 있다.

진짜 도구의 코드 대부분은 예외를 다루는 코드다

전사체에 붙이면 스플라이싱 문제가 사라집니다 — 대신 볼 수도 없게 되죠.

Python 브라우저에서 실행

import bu

# 우리 방식이 엑손 경계를 어떻게 '피해 가는지' 눈으로 봅니다
p = bu.panel()
seq = p["Actb"]
print(f"Actb 전사체 (성숙 mRNA) : {len(seq):,} 염기")
print(f"  {seq[:76]}")
print()
print("이 서열에는 인트론이 없습니다 — 이미 잘려 나간 뒤니까요.")
print("게놈에 붙였다면 이 76 글자가 두세 조각으로 나뉘어 앉았을 수도 있습니다.")
print()
print("우리 read 중 몇 개나 이 전사체에 붙나:")
idx = bu.index()
n = sum(1 for _, s, _q in bu.reads("WT_1") if bu.assign(s, idx) == "Actb")
print(f"  {n}개")

고등학생가장 큰 차이는 '이어 붙이기' 다

사람 유전자는 엑손과 인트론으로 나뉘어 있다. 전사된 뒤 인트론이 잘려 나가고 엑손끼리 이어 붙는다(스플라이싱).

그래서 read 가 유전체에 안 붙는다

mRNA 에서 나온 read 가 엑손 경계를 걸치고 있으면, 그 서열은 유전체 어디에도 연속으로 존재하지 않는다. 앞 40글자는 엑손 3에, 뒤 36글자는 엑손 4에 있다. 사이에는 인트론 수천 글자가 있다.

이런 read 를 붙이려면 정렬기가 read 를 쪼개서 따로 붙일 줄 알아야 한다. STAR 의 S 가 spliced 의 S 다. 이것이 STAR 를 어렵고 무겁게 만드는 이유다.

	엑손 안 read	경계 걸친 read
비율	약 65~70%	약 30~35%
우리 코드	처리함	놓침

read 세 개 중 하나가 엑손 경계를 걸친다 — 무시할 수 없는 수다

못 붙은 것을 더 잘게 나눠 세면 무엇을 놓쳤는지 보입니다.

Python 브라우저에서 실행

import bu

# 우리가 못 붙인 read 는 정말 '패널 밖' 인가 — rRNA 를 빼고 세어 본다
idx = bu.index()
rs = bu.reads("WT_1", 5000)

mapped = rrna = other = 0
for _, s, _q in rs:
    if bu.assign(s, idx):
        mapped += 1
    elif bu.is_rrna(s):
        rrna += 1
    else:
        other += 1

n = len(rs)
print(f"패널 유전자에 붙음   {mapped:>5}  ({mapped/n*100:>5.1f} %)")
print(f"리보솜 RNA           {rrna:>5}  ({rrna/n*100:>5.1f} %)")
print(f"둘 다 아님           {other:>5}  ({other/n*100:>5.1f} %)")
print()
print("'둘 다 아님' 이 절반을 넘습니다. 대부분 패널 밖 유전자에서 온 것이고,")
print("진짜 파이프라인이라면 이 중 상당수를 어딘가에 붙였을 것입니다.")

그러면 우리가 만든 것은 쓸모없나

아닙니다. 같은 뼈대이기 때문입니다.

우리가 실제로 배운 것

참조 선택이 결과를 좌우한다 · 깊이가 정확도를 만든다 · multi-mapping 은 처리 방식을 정해야 한다 · 천장을 계산해야 점수를 읽을 수 있다

이 넷은 도구를 바꿔도 그대로다

우리가 못 배운 것

스플라이싱 · 이형질체 정량 · 편향 모형 · 정렬 알고리즘의 내부

여기부터는 도구를 써야 한다

실제로 돌린다면 명령은 이 정도입니다.

salmon index -t transcripts.fa -i idx -k 31 salmon quant -i idx -l A -r WT_1.fastq.gz -o WT_1 --validateMappings

-k 31 이 눈에 익지 않나요? 10강에서 우리가 고른 그 31 입니다.

고등학생그 밖에 진짜 도구가 더 하는 것들

기능	왜 필요한가
불일치 · 삽입결실 허용	변이와 시퀀싱 오류가 있는 read 를 살림
soft-clipping	read 끝 어댑터를 자동으로 무시 (8강의 결과 설명)
페어엔드 처리	양끝을 함께 봐서 위치를 확정
다중 매핑 EM 배분	12강
GC · 위치 편향 보정	라이브러리 제작 편향을 모형으로 보정
병렬 처리 · 메모리 관리	수십억 read 를 실용적 시간에

마지막 줄이 의외로 큰 부분이다

알고리즘이 아무리 좋아도 사람 유전체 색인이 메모리에 안 들어가면 못 쓴다. STAR 가 30GB 램을 요구하고 salmon 이 4GB 로 되는 차이가 실무에서는 도구 선택을 좌우 한다.

계산 복잡도만이 아니라 메모리와 입출력 이 실제 제약이라는 것 — /ca 과목에서 다루는 이야기가 여기서 실체를 갖는다.

쓸 수 있는 도구가 좋은 도구다 — 자원 요구량도 성능의 일부다

🎮 파이프라인 비교기

단계별로 우리 방식과 실제 도구가 무엇을 다르게 하는지 확인하세요.

고등학생그럼 우리 여덟 줄은 무엇이었나

진짜 도구를 쓸 것이면서 왜 손으로 짰나?

손으로 짜서 얻은 것
도구의 로그 메시지를 읽을 수 있게 됨
옵션이 무엇을 바꾸는지 짐작할 수 있게 됨
결과가 이상할 때 어디를 볼지 알게 됨
도구가 없는 새 문제를 만났을 때 시작점이 생김

블랙박스와 유리 상자

도구를 블랙박스로 쓰면 잘 될 때는 문제가 없다. 문제는 안 될 때다. 안에서 무슨 일이 일어나는지 모르면 할 수 있는 것이 "옵션을 이것저것 바꿔 보기" 뿐이다.

여덟 줄을 짜 봤으면 그 상자가 반쯤 유리가 된다. 완전히 이해하지는 못해도 어디를 의심할지는 안다.

축소판을 손으로 만들어 본 사람만이 진짜를 디버깅할 수 있다

🤔 확인 문제

STAR 의 이름 첫 글자 S 가 뜻하는 것과, 그것이 필요한 이유는?

🤔 확인 문제

우리가 전사체(cDNA)에 붙여서 피한 문제이자 동시에 잃은 것은?

🤔 확인 문제

우리 방식으로도 배울 수 있었던 것에 해당하지 않는 것은?