15강 / 20강

깊이가 정확도를 만든다 — 왜 2,700만 개를 읽는가

500 개에서 20,000 개까지 · 그리고 Ddx54 는 끝내 안 보인다

read 를 하나 뽑는 것은 주머니에서 공을 하나 꺼내는 일과 같습니다. 주머니 안의 비율은 정해져 있고, 우리는 그 비율을 추정하는 것이죠.

100번 뽑아서 1%짜리를 맞힐 확률은 63%,
0.01%짜리를 맞힐 확률은 1%입니다. 드문 것을 보려면 많이 뽑아야 합니다.

read 수를 줄여 가며 정확도가 어떻게 변하는지 재어 봅시다.

고등학생왜 2,700만 개나 읽는가

read 를 많이 읽을수록 좋다는 것은 안다. 그런데 얼마나 좋아지나? 그리고 어디서 멈춰야 하나? 이 강의는 그것을 직접 재 본다.

깊이란

시퀀싱 깊이(depth)는 read 총수다. 여론조사에서 표본 크기와 같은 역할을 한다. 1,000명에게 물으면 오차가 ±3%, 100명에게 물으면 ±10%. 정확도는 표본 크기의 제곱근에 비례해서 좋아진다.

read 수	상대 오차
100	10%
400	5%
10,000	1%

네 배를 읽어야 오차가 절반이 된다. 수익 체감 이 심하다.

깊이를 두 배로 하면 정확도는 √2 배만 좋아진다

read 를 두 배로 늘릴 때마다 r 이 얼마나 오르는지 보세요.

Python 브라우저에서 실행

import bu
import numpy as np, random
from collections import Counter
from scipy import stats

idx = bu.index()
rs = [s for _, s, _q in bu.reads("WT_1")]
random.Random(20260822).shuffle(rs)

cpm = bu.cpm(bu.published())
genes = sorted(bu.panel())
truth = cpm["WT_DDX54_1"].reindex(genes).fillna(0)

print(f"{'read':>8}{'붙은 것':>9}{'나온 유전자':>12}{'pearson':>10}")
print("-" * 40)
for n in [500, 1000, 2000, 5000, 10000, 20000]:
    c = Counter()
    for s in rs[:n]:
        g = bu.assign(s, idx)
        if g:
            c[g] += 1
    m = np.array([c.get(g, 0) for g in genes], dtype=float)
    r = stats.pearsonr(np.log2(m + 1), np.log2(truth + 1))[0]
    print(f"{n:>8,}{int(m.sum()):>9,}{int((m > 0).sum()):>12}{r:>10.3f}")

곡선이 아직 안 눕는다

500 → 20,000 으로 40배 늘렸는데 r 이 0.43 → 0.76 입니다. 아직 오르는 중이죠. 곡선이 눕지 않았다는 것은 read 를 더 넣으면 더 좋아진다는 뜻입니다.

얼마나 더 넣어야 할까요? 논문은 표본당 2,700만 개를 넣었습니다. 우리의 1,350배 입니다.

흔한 유전자

Actb·Rpl13 은 500 read 로도 잡힙니다. 비율이 크니까요.

드문 유전자

Ddx54 는 CPM 65 — 백만 개 중 65개입니다. 20,000 read 를 뽑으면 기댓값이 1.3개 예요.

고등학생500 개에서 20,000 개까지 늘려 본다

같은 자료에서 read 를 조금씩 뽑아 표를 만들고, 공개 표와의 상관을 재 본다. read 수를 늘려 가면서.

기대되는 곡선의 모양

처음에는 가파르게 오르고, 나중에는 평평해진다. 포화 곡선 이다. 어느 지점을 넘으면 더 읽어도 거의 안 좋아진다.

구간	일어나는 일
아주 적을 때	흔한 유전자만 겨우 보임 · 상관 낮음
중간	중간 발현 유전자가 들어옴 · 상관 급상승
많을 때	희귀 유전자만 추가됨 · 상관 거의 안 변함

이 곡선이 실험 설계 도구다

이미 얻은 자료로 곡선을 그리면 "더 읽으면 얼마나 좋아질까" 를 예측 할 수 있다. 평평한 구간에 있으면 더 읽는 것은 돈 낭비다. 시료를 하나 더 넣는 편이 훨씬 낫다.

깊이를 늘릴지 시료를 늘릴지는 이 곡선이 대답한다

기댓값과 실제가 맞으면 우리 방법이 편향 없이 뽑고 있다는 뜻입니다.

Python 브라우저에서 실행

import bu

# 이 강의의 주인공은 우리 표에서 보이나?
T = bu.table()
cpm = bu.cpm(bu.published())

for g in ["Actb", "Rpl13", "Vim", "Ddx54", "Cd47", "Myc"]:
    if g not in T.index:
        continue
    pub_cpm = cpm.loc[g].mean()
    got = T.loc[g].sum()
    expect = pub_cpm * 44000 * 0.26 / 1e6      # 붙는 비율 26%를 감안한 기댓값
    print(f"{g:<8} 공개 CPM {pub_cpm:>8.0f}   우리 표 합계 {got:>4}   "
          f"(기댓값 {expect:>5.1f})")
print()
print("Ddx54 는 이 논문의 주인공인데 우리 표에서는 2개뿐입니다.")
print("44,000 read 로는 이 유전자를 '봤다' 고 말할 수 없습니다.")

고등학생Ddx54 는 끝내 안 보인다

read 를 20,000개까지 늘려도 Ddx54 유전자는 나타나지 않는다. 왜인가?

발현량이 낮으면 확률적으로 안 잡힌다

전체 전사체의 0.001% 를 차지하는 유전자가 있다고 하자. read 20,000개를 뽑으면 기대 개수는 0.2개 다. 푸아송 분포로 계산하면 0개일 확률이 약 82%.

기대 개수	0개일 확률
0.2	82%
1	37%
3	5%
5	0.7%

여기서 나오는 실용 규칙

어떤 유전자를 안정적으로 검출 하려면 기대 개수가 최소 3~5개는 되어야 한다. 그보다 낮으면 "이 시료에서는 있고 저 시료에서는 없다" 가 생물학이 아니라 동전 던지기 다.

낮게 발현되는 유전자의 "있다/없다" 는 대개 잡음이다

몇 종이 나오나와 얼마나 정확하나는 포화 속도가 다릅니다.

Python 브라우저에서 실행

import bu
import random
from collections import Counter

# 몇 개를 읽으면 유전자가 다 나오나 — 포화 곡선
idx = bu.index()
rs = [s for _, s, _q in bu.reads("WT_1")]
random.Random(20260822).shuffle(rs)

c = Counter()
marks = [100, 250, 500, 1000, 2000, 4000, 8000, 12000, 16000, 20000]
print(f"{'read':>8}{'나온 유전자':>12}{'새로 나온 것':>13}")
print("-" * 34)
prev = 0
for i, s in enumerate(rs, 1):
    g = bu.assign(s, idx)
    if g:
        c[g] += 1
    if i in marks:
        print(f"{i:>8,}{len(c):>12}{len(c)-prev:>13}")
        prev = len(c)
print()
print(f"패널 {len(bu.panel())}개 중 {len(c)}개가 나왔습니다.")
print("곡선이 눕고 있습니다 — '유전자 목록' 은 거의 포화했다는 뜻이죠.")
print("하지만 '정확한 카운트' 는 아직 멀었습니다(위의 r 곡선). 둘은 다른 질문입니다.")

🎮 깊이 실험실

read 수를 옮기며 정확도와 검출 유전자 수가 어떻게 변하는지 보세요.

고등학생그래서 몇 개를 읽어야 하나

목적	권장 깊이 (시료당)
발현 차이 검출 (흔한 유전자)	1,000만~2,000만
희귀 전사체 · 비암호 RNA	5,000만 이상
전사체(isoform) 수준 정량	3,000만 이상 · 페어엔드
단일세포	세포당 2만~5만 (다른 이야기)

깊이보다 중요한 것

통계적으로 보면, 생물학적 반복수(replicate)를 늘리는 것 이 깊이를 늘리는 것보다 거의 언제나 낫다.

깊이는 기술적 잡음 을 줄인다. 반복은 생물학적 변이 를 잡는다. 그런데 실제 실험에서 결론을 흔드는 것은 대개 후자다. 같은 예산이면 시료 3개를 깊게 읽는 것보다 시료 6개를 얕게 읽는 편이 낫다는 계산이 여러 번 나왔다.

깊이는 측정을 정밀하게, 반복은 결론을 튼튼하게 만든다

🤔 확인 문제

read 를 40배 늘렸는데 r 이 0.43 → 0.76 으로 아직 오르는 중이라는 것은?

🤔 확인 문제

CPM 65 인 Ddx54 를 44,000 read 에서 몇 개나 기대할 수 있나?

🤔 확인 문제

같은 예산이라면 대개 어느 쪽이 나은가?