7강 / 20강

read 끝에 붙은 것들 — 어댑터와 polyA 꼬리

어댑터는 0.3% 뿐인데 polyA 는 20% · 무엇이 진짜 문제인가

라이브러리를 만들 때 RNA 조각의 양 끝에 어댑터라는 짧은 DNA 를 붙입니다. 시퀀서가 붙잡을 손잡이입니다.

[어댑터]—————— 내 RNA 조각 ——————[어댑터] └── 여기서부터 76 글자를 읽는다 ──┘

조각이 76bp 보다 길면 문제가 없습니다. 그런데 조각이 짧으면 76 글자를 채우려고 반대쪽 어댑터까지 읽어 버립니다. 그 read 의 뒷부분은 내 RNA 가 아닙니다.

Illumina TruSeq 어댑터는 AGATCGGAAGAGC 로 시작합니다. 찾아봅시다.

고등학생read 끝에 붙는 두 가지 쓰레기

read 끝에 원래 서열이 아닌 것이 붙어 있는 경우가 있다. 둘이다.

	어댑터	polyA 꼬리
정체	실험용 인공 서열	mRNA 의 진짜 일부
왜 읽히나	원본 조각이 76글자보다 짧아서	꼬리 쪽에서 read 가 시작돼서
이 자료에서	0.3%	20%

어댑터가 왜 읽히는지

시퀀싱 준비 과정에서 RNA 조각 양쪽에 어댑터를 붙인다. 기계는 어댑터를 발판 삼아 안쪽으로 76글자를 읽는다. 조각이 100글자면 어댑터를 안 만난다. 조각이 50글자면 50글자 읽고 나머지 26글자는 반대쪽 어댑터를 읽는다.

어댑터가 보인다는 것은 원본 조각이 read 보다 짧았다는 신호다

어댑터가 보인다는 것은 그 조각이 76bp 보다 짧았다는 뜻입니다.

Python 브라우저에서 실행

import bu

ADAPTER = "AGATCGGAAGAGC"
rs = bu.reads("WT_1")

hits = [(s, s.find(ADAPTER)) for _, s, _q in rs if ADAPTER in s]
print(f"어댑터가 보이는 read : {len(hits):,} / {len(rs):,}  ({len(hits)/len(rs)*100:.2f} %)")
print()
for s, at in hits[:5]:
    print(f"  {at:>3}번 자리부터  {s[:at]}|{s[at:]}")
print()
print("0.3% 남짓입니다 — 조각 길이를 잘 맞춰 만든 라이브러리라는 뜻입니다.")

mRNA 3' 끝의 꼬리까지 읽어 들어간 것입니다. polyA 선별을 했다는 증거이기도 합니다.

Python 브라우저에서 실행

import bu, re
from collections import Counter

rs = bu.reads("WT_1")
polya = [s for _, s, _q in rs if "A" * 12 in s]
print(f"A 가 12개 넘게 이어지는 read : {len(polya):,} / {len(rs):,}"
      f"  ({len(polya)/len(rs)*100:.1f} %)")

# 그 A 뭉치는 read 의 어디에 있나
pos = Counter()
for s in polya:
    m = max(re.finditer(r"A{12,}", s), key=lambda x: x.end() - x.start())
    pos[m.start() // 10 * 10] += 1

print()
print("A 뭉치가 시작하는 자리")
for k in sorted(pos):
    print(f"  {k:>2}~{k+9:>2}번  {pos[k]:>5}  {'▇' * (pos[k] // 40)}")
print()
print("read 뒤쪽(50번 이후)에 몰려 있습니다 — 이것이 polyA 꼬리입니다.")

고등학생0.3% 대 20% — 어느 쪽이 문제인가

보통 사람들이 걱정하는 것은 어댑터다. 도구도 어댑터 제거에 집중한다. 그런데 이 자료에서 어댑터는 0.3% 뿐이다. polyA 는 20% 다. 예순 배 이상 차이다.

그런데 polyA 는 "쓰레기" 가 아니다

어댑터는 인공 서열이라 명백히 제거 대상이다. polyA 는 mRNA 의 진짜 일부다. 세포가 만든 것이다.

문제는 정보가 없다 는 것이다. AAAAAAAA… 는 어느 유전자에서 왔는지 알려주지 않는다. 모든 mRNA 가 그 꼬리를 갖고 있으니까. 진짜지만 쓸모없는 서열이다.

	진짜인가	정보가 있나	처리
어댑터	아니오	없음	무조건 제거
polyA	예	없음	제거해도 되고 안 해도 됨

문제의 크기를 재 보기 전에는 어디를 고칠지 알 수 없다

짐작을 재어 보는 습관. '덜 붙을 것 같다' 와 '3분의 1 깎인다' 는 다른 말입니다.

Python 브라우저에서 실행

import bu

# polyA 가 든 read 는 정말 덜 붙나
idx = bu.index()
rs = bu.reads("WT_1")

with_a = [s for _, s, _q in rs if "A" * 12 in s]
without = [s for _, s, _q in rs if "A" * 12 not in s]

a_hit = sum(1 for s in with_a[:2000] if bu.assign(s, idx))
w_hit = sum(1 for s in without[:2000] if bu.assign(s, idx))

print(f"polyA 있는 read : {a_hit}/2,000 붙음 ({a_hit/20:.1f} %)")
print(f"polyA 없는 read : {w_hit}/2,000 붙음 ({w_hit/20:.1f} %)")
print()
print("확실히 덜 붙습니다 — 28.8% 대 18.7%, 3분의 1이 깎였습니다.")
print("그래도 다섯에 하나는 붙습니다. A 뭉치가 뒤쪽에 있어서")
print("앞쪽 50 글자는 여전히 멀쩡한 유전자 서열이기 때문입니다.")

고등학생polyA 가 20% 라는 것의 뜻

read 다섯 개 중 하나가 꼬리 쪽에 치우쳐 있다는 것은, 3' 편향 이 심하다는 신호다.

3' 편향이 왜 생기나

polyA 선별은 A 꼬리를 낚아챈다. RNA 가 분해되어 있으면 꼬리 쪽 조각만 낚이고 앞쪽은 잃는다. RNA 품질이 나쁠수록 3' 편향이 심해진다.

연이 끊어져 날아갈 때 손에 남는 것은 실 끝뿐인 것과 같다. 잡고 있던 쪽만 남는다.

이것이 하류에 미치는 영향

영향	정도
유전자 발현량 세기	대체로 괜찮음 — 꼬리도 그 유전자니까
이어붙이기(splicing) 분석	나쁨 — 앞쪽 엑손을 못 봄
전사 시작점 분석	불가능
긴 유전자 vs 짧은 유전자	편향 — 16강에서 다룸

같은 자료가 어떤 질문에는 충분하고 어떤 질문에는 못 쓴다

🎮 read 끝 탐색기

어댑터·polyA 가 든 read 를 골라 어디서부터 남의 서열인지 보세요.

고등학생그럼 잘라야 하나

다음 강에서 실제로 잘라 보고 결과를 비교한다. 그전에 무엇을 기대할지 를 정해 두자. 이것이 실험의 기본이다.

예상 세 가지

예상	맞다면 뜻하는 것
많이 좋아진다	polyA 가 정렬을 방해하고 있었다
조금 좋아진다	정렬 도구가 이미 알아서 처리하고 있었다
변화 없다	자를 필요가 없었다 — 시간 낭비

결과를 보기 전에 예상을 적어 두는 것 이 중요하다. 결과를 본 뒤에는 어떤 결과든 그럴듯해 보인다. 미리 적어야 자기가 틀렸다는 것을 알 수 있다.

예측을 먼저 쓰고 실험한다 — 이것이 분석을 과학으로 만드는 절차다

🤔 확인 문제

read 에 어댑터 서열이 보이면 그것이 뜻하는 것은?

🤔 확인 문제

이 자료에서 polyA 가 20% 나 보이는 이유는?

🤔 확인 문제

polyA 가 든 read 도 상당수가 유전자에 붙는 이유는?