6강 / 20강

가장 흔한 서열의 정체 — read 다섯 개 중 하나가 리보솜

45S rDNA 에서 그 자리를 찾아낸다 · 왜 돈을 20% 버렸나

5강에서 가장 많이 나온 서열들이 우리 유전자 패널에 하나도 붙지 않았습니다. 정체를 밝힐 차례입니다.

세포 안 RNA 의 80~90%는 리보솜 RNA(rRNA) 입니다. 28S · 18S · 5.8S 세 덩어리이고, 셋은 45S 전구체 하나에서 잘려 나옵니다. mRNA 를 보려고 시퀀싱했는데 rRNA 가 섞여 들어오면, 그만큼 돈을 버리는 셈이죠.

그래서 라이브러리를 만들 때 둘 중 하나를 합니다.

polyA 선별 — 꼬리에 A 가 달린 것만 건진다 (mRNA 는 달려 있고 rRNA 는 없다)
rRNA 제거 — rRNA 에 달라붙는 탐침으로 걷어 낸다

이 자료는 polyA 선별을 썼습니다(7강에서 확인합니다). 그런데도 rRNA 가 남습니다. 얼마나 남았는지 세어 봅시다.

고등학생read 다섯 개 중 하나가 리보솜

가장 흔한 서열을 꼽아 보면, 상위권이 전부 리보솜 RNA(rRNA) 다. 전체 read 의 약 20% — 다섯 개 중 하나.

왜 이렇게 많나

세포 안 RNA 를 무게로 재면 80~90% 가 rRNA 다. 우리가 보고 싶은 mRNA 는 1~5% 밖에 안 된다. 아무 처리 없이 RNA 를 다 읽으면 rRNA 만 잔뜩 읽게 된다.

RNA 종류	세포 안 비율	우리 관심
rRNA	80~90%	거의 없음
tRNA	10~15%	거의 없음
mRNA	1~5%	이것이 목표

세포에서 가장 흔한 것과 우리가 알고 싶은 것은 다르다

패널에는 없던 서열들이 rDNA 안에서는 정확한 자리를 갖습니다.

Python 브라우저에서 실행

import bu

rdna = bu.rdna()
print(f"생쥐 45S rDNA 반복단위 : {len(rdna):,} 염기 (GenBank BK000964)")
print()

# 5강에서 가장 많이 나온 서열을 이 안에서 찾아본다
from collections import Counter
c = Counter(s[:50] for _, s, _q in bu.reads("WT_1"))

print(f"{'횟수':>5}  {'rDNA 안 위치':>12}  서열 앞 34")
print("-" * 66)
for s50, k in c.most_common(6):
    at = rdna.find(s50)
    if at < 0:
        at = bu.rc(rdna).find(s50)
        where = f"역상보 {at:,}" if at >= 0 else "못 찾음"
    else:
        where = f"{at:,}"
    print(f"{k:>5}  {where:>12}  {s50[:34]}")

고등학생그래서 실험에서 걸러 낸다 — 두 가지 방법

방법	원리	특징
polyA 선별	mRNA 의 A 꼬리를 낚아챔	간단 · 싸다 · 꼬리 없는 RNA 를 잃음
rRNA 제거	rRNA 에 붙는 탐침으로 빼냄	비쌈 · 비암호 RNA 까지 살림

이 자료는 polyA 선별을 했다

그런데도 rRNA 가 20% 남았다. 완벽한 걸러 내기는 없다 는 뜻이다. rRNA 도 아주 소량은 polyA 를 갖거나, 낚싯대에 우연히 걸린다.

그물로 물고기를 잡을 때 그물코보다 작은 것도 조금은 걸리는 것과 같다. 선별은 확률을 바꿀 뿐 0으로 만들지 못한다.

20% 는 실험 실패가 아니라 선별의 통상적인 누출량이다

is_rrna 는 rDNA 의 k-mer 집합에 걸리는지 보는 것이 전부입니다.

Python 브라우저에서 실행

import bu

# 표본마다 rRNA 가 얼마나 섞였나
print(f"{'표본':<7}{'rRNA 비율':>11}   {'무리':<4}")
print("-" * 30)
for s in bu.SAMPLES:
    rs = bu.reads(s, 4000)
    rr = sum(1 for _, seq, _q in rs if bu.is_rrna(seq))
    print(f"{s:<7}{rr/len(rs)*100:>10.2f}%   {'WT' if s in bu.WT else 'KD'}")
print()
print("150만 read 로 재면 WT 19.6~22.3% · KD 16.1~16.9% 입니다 (위젯).")
print("5강의 중복률과 똑같은 방향으로 갈립니다 — 같은 배치 문제로 보입니다.")

20%는 얼마나 비싼가

표본당 2,700만 read 를 읽었으니, rRNA 20%는 표본마다 540만 read 입니다. 일곱 표본이면 3,800만 read — 시퀀싱 비용의 5분의 1을 리보솜 RNA 를 세는 데 썼습니다.

그래도 이 정도는 나쁘지 않은 편입니다. polyA 선별이 잘 안 되면 50%를 넘기도 하고, 조직·혈액 시료에서는 더합니다.

중요한 것은 rRNA 를 지우느냐 입니다. 답은 지울 필요가 없다 입니다 — 어차피 유전자에 안 붙으니 카운트에 안 들어갑니다. 다만 정규화할 때 조심해야 합니다. "전체 read 의 몇 %" 로 세면 rRNA 비율이 다른 표본끼리 어긋나거든요. 유전자에 붙은 read 만으로 총합을 잡아야 합니다 — 14강에서 그렇게 합니다.

🎮 오염 탐지기

가장 흔한 서열들이 rDNA 어디에서 왔는지 지도 위에서 확인하세요.

고등학생돈으로 환산하면

시퀀싱 비용은 read 개수로 매겨진다. rRNA 가 20% 라는 것은 지불한 돈의 20% 를 버렸다 는 뜻이다.

항목	비율
rRNA	약 20% — 쓸모없음
polyA 만 잔뜩 (7강)	약 20% — 정보 적음
실제 유전자 서열	나머지

그래서 실험 설계가 중요하다

같은 예산으로 유용한 read 를 몇 개 얻느냐가 rRNA 제거 효율에 달려 있다. 시퀀싱을 두 배 더 하는 것보다 라이브러리를 잘 만드는 것 이 싸다.

이것이 이 강의가 전처리를 강조하는 실용적인 이유다. 분석 단계에서 아무리 잘해도 읽히지 않은 것을 살려낼 수는 없다.

계산은 나중에 고칠 수 있지만 실험은 다시 해야 고친다

🤔 확인 문제

polyA 선별을 했는데도 rRNA 가 20% 남는 이유로 알맞은 것은?

🤔 확인 문제

rRNA read 를 파일에서 지우지 않아도 되는 이유는?

🤔 확인 문제

가장 흔한 서열이 rDNA 의 8,122 번 자리에서 시작한다는 사실이 알려 주는 것은?