5강 / 20강

같은 RNA-Seq 이 아니다 — PolyA 와 리보솜 제거

이 강의 RNA-Seq 433개 run 의 LibrarySelection 실제 분포

4강에서 LibraryStrategy 로 걸렀습니다. RNA-Seq 만 433개예요. 이제 다 같은 자료일까요?

아닙니다. LibrarySelection 을 보면 여덟 가지가 섞여 있습니다.

선택	run 수	무엇을 골랐나
`cDNA`	248	구체적으로 안 적었다는 뜻에 가깝습니다
`PolyA`	45	꼬리(polyA)가 달린 RNA 만 낚아 올렸다
`Oligo-dT`	41	같은 방법의 다른 이름
`Inverse rRNA`	27	리보솜 RNA 만 빼고 나머지를 다 남겼다
`cDNA_randomPriming`	27	무작위로 시작점을 잡았다
`PCR`	19	특정 부위만 증폭
`RANDOM PCR`	15	무작위 + 증폭
`RANDOM`	11	무작위

고등학생두 가지 방법

	PolyA 선택	리보솜 제거 (rRNA depletion)
방법	mRNA의 polyA 꼬리를 낚아챔	rRNA에 붙는 미끼로 rRNA를 제거
잡는 것	polyA가 있는 성숙 mRNA	rRNA 뺀 모든 RNA
놓치는 것	polyA 없는 RNA (히스톤, 많은 lncRNA)	—
분해된 RNA	취약 — 꼬리가 끊기면 못 잡음	강함 — FFPE에 유리
비용	저렴	비쌈

낚싯대로 특정 물고기만 낚는 것과, 그물로 다 잡고 원치 않는 것을 골라내는 것의 차이입니다.

사후 뇌조직 연구가 리보솜 제거를 쓰는 이유가 이것입니다.

Python 브라우저에서 실행

# 두 방법으로 잡히는 RNA 가 얼마나 다른가.
rna_types = [
    ("단백질 만드는 mRNA",     "있다",     "잡힌다", "잡힌다"),
    ("긴 비암호화 RNA (lncRNA)", "대개 있다", "일부만", "잡힌다"),
    ("히스톤 mRNA",            "없다",     "놓친다", "잡힌다"),
    ("전구체 RNA (인트론 포함)","없다",     "놓친다", "잡힌다"),
    ("원형 RNA (circRNA)",     "없다",     "놓친다", "잡힌다"),
    ("분해되기 시작한 RNA",     "잘림",     "놓친다", "일부 잡힌다"),
]
print(f"{'RNA 종류':26s} {'polyA 꼬리':>10s} {'PolyA 선택':>11s} {'리보솜 제거':>12s}")
for name, tail, polya, ribo in rna_types:
    print(f"{name:26s} {tail:>10s} {polya:>11s} {ribo:>12s}")
print()
print("사후 조직처럼 RNA 가 분해된 표본에서는")
print("리보솜 제거 쪽이 훨씬 유리합니다 — 꼬리가 잘려 나갔거든요.")

고등학생이 차이가 결과를 바꾼다

보려는 것	PolyA	rRNA 제거
단백질 코딩 유전자	좋음	좋음
lncRNA	일부만	더 잘 잡음
인트론 (미성숙 RNA)	거의 없음	많이 잡힘
원형 RNA	못 잡음	잡을 수 있음
FFPE 시료	어려움	가능

그래서 두 방식의 자료를 그냥 합치면 안 됩니다. 유전자마다 검출되는 정도가 계통적으로 달라요.

라이브러리 만드는 법이 배치가 됩니다.

Python 브라우저에서 실행

# 선택 방법이 뒤엉키면 — /geo 15강과 같은 계산.
import numpy as np
rng = np.random.default_rng(9)

n = 40
# 이 lncRNA 는 병과 무관합니다. 다만 리보솜 제거에서만 잘 잡혀요.
grp = np.array(["case"]*20 + ["ctrl"]*20)
# 환자가 리보솜 제거 연구에 몰려 있다면
sel = np.array(["ribo"]*17 + ["polya"]*3 + ["polya"]*17 + ["ribo"]*3)

true_disease = 0.0        # 병 효과는 없다
method       = 2.5        # 방법 효과는 크다
x = np.where(grp == "case", true_disease, 0) + np.where(sel == "ribo", method, 0)     + rng.normal(0, .4, n)

print(f"진짜 병 효과       : {true_disease:+.2f}")
print(f"그냥 계산하면      : {x[grp=='case'].mean() - x[grp=='ctrl'].mean():+.2f}")
print()
for s in ["ribo", "polya"]:
    m = sel == s
    if (m & (grp=='case')).sum() and (m & (grp=='ctrl')).sum():
        d = x[m & (grp=='case')].mean() - x[m & (grp=='ctrl')].mean()
        print(f"  {s:6s} 안에서만: {d:+.2f}  (환자 {(m&(grp=='case')).sum()}, 대조 {(m&(grp=='ctrl')).sum()})")
print()
print("방법 안에서 따로 보면 0 근처입니다. 뒤엉킨 채로 보면 +2 가 넘어요.")

고등학생합칠 때의 대처

방법	내용
같은 방식끼리만 비교	가장 안전 · 표본이 줄어듦
방식을 공변량으로 넣음	통계 모형에 포함
영향받는 유전자를 제외	lncRNA·히스톤 등을 뺌
배치로 취급	14강의 배치 보정

14강에서 볼 배치 문제의 한 종류입니다 — 기술적 차이가 생물학적 차이처럼 보입니다.

🤔 확인 문제

사후 뇌조직처럼 RNA 가 분해된 표본에서 리보솜 제거법이 유리한 이유는?

🤔 확인 문제

PolyA 로 만든 연구와 리보솜 제거로 만든 연구를 합쳐 lncRNA 를 비교하면?