7강 / 20강

4,828배 — run 마다 깊이가 이만큼 다르다

713 run 의 bases 분포 · 3,533만 부터 1,705억까지

이 강의가 모은 713개 run 의 염기 수를 재 봤습니다.

분위수	염기 수	대략
최소	35,331,896	0.035 Gb
5%	743,682,107	0.7 Gb
25%	6,282,660,900	6.3 Gb
중앙값	8,222,420,400	8.2 Gb
75%	13,131,059,400	13 Gb
95%	71,552,223,645	72 Gb
최대	170,566,132,738	171 Gb

최대 ÷ 최소 = 4,828배

고등학생4,828배

713 run의 bases(총 읽은 염기 수)를 비교하니 최소와 최대가 4,828배 차이 났습니다.

	값
가장 얕은 run	3,533만 염기
가장 깊은 run	1,705억 염기
비율	약 4,828배

사진에 비유하면 하나는 저해상도 썸네일, 다른 하나는 초고화질 원본입니다.

고등학생깊이가 왜 다른가

이유	내용
연구 목적	발현 정량은 얕게, 변이 탐색은 깊게
시대	옛 자료는 장비 성능 때문에 얕음
예산	표본 수와 깊이의 맞바꿈
시료 상태	RNA 양이 적으면 깊이가 안 나옴
다중화	한 레인에 몇 시료를 올렸나

다섯 번째가 실무적으로 큽니다. 시퀀싱 한 번에 여러 시료를 바코드로 섞어 올리는데, 몇 개를 올렸느냐가 시료당 깊이를 정해요.

얕게 읽으면 낮은 발현 유전자가 통째로 사라집니다.

Python 브라우저에서 실행

# 깊이가 얕으면 낮은 발현 유전자가 사라진다.
import numpy as np
rng = np.random.default_rng(4)

# 유전자 여섯 개의 '진짜' 비율 (전체 전사체 중 차지하는 몫)
genes = {"아주 높다": 5e-2, "높다": 5e-3, "보통": 5e-4,
         "낮다": 5e-5, "아주 낮다": 5e-6, "거의 없다": 5e-7}

depths = [1_000_000, 5_000_000, 20_000_000, 100_000_000]
print(f"{'유전자':12s} " + "".join(f"{d//1_000_000:>7d}M" for d in depths))
for name, frac in genes.items():
    counts = [rng.poisson(frac * d) for d in depths]
    print(f"{name:12s} " + "".join(f"{c:8d}" for c in counts))
print()
print("'낮다' 이하는 백만 read 에서 0 입니다 — 없는 게 아니라 못 본 거예요.")
print("그리고 0 과 0 은 견줄 수가 없습니다.")

고등학생깊이가 결과에 미치는 영향

깊이가 얕으면	일어나는 일
발현 낮은 유전자가 0으로	검출 안 됨 — "없다"가 아님
계수 자료의 분산이 큼	차등 발현 검정력 저하
드문 아이소폼을 놓침	스플라이싱 분석 불가
변이 검출 불가	변이를 보려면 훨씬 깊어야

깊이가 다른 자료를 합치면, 얕은 자료에서만 유전자가 사라져 가짜 차이가 생깁니다.

공평하게 만드는 값은 정보를 버리는 것입니다.

Python 브라우저에서 실행

# 깎아서 맞추기(downsampling) 가 무엇을 버리는가.
import numpy as np
rng = np.random.default_rng(8)

deep, shallow = 40_000_000, 4_000_000
n_genes = 20000
# 유전자 발현의 대략적인 분포 (로그정규)
frac = rng.lognormal(-9, 2.2, n_genes); frac /= frac.sum()

for name, d in [("깊은 자료", deep), ("얕은 자료", shallow), ("깊은 것을 깎으면", shallow)]:
    c = rng.poisson(frac * d)
    print(f"{name:16s} 깊이 {d:11,d}   0 이 아닌 유전자 {(c>0).sum():6,d} / {n_genes:,}")
print()
print("깎으면 깊은 자료의 이점이 사라집니다 — 얕은 쪽과 같아져요.")
print("대신 두 자료를 '같은 조건' 에서 견줄 수 있게 됩니다.")

고등학생그래서 정규화가 필요하다

깊이 차이를 보정하지 않으면 비교가 안 됩니다. 12강에서 그 방법을 봅니다.

보정	맞추는 것
CPM	총 read 수 — 깊이
TPM	깊이 + 유전자 길이
크기인자 (DESeq2 등)	깊이 + 조성 편향

다만 정규화가 만능은 아닙니다. 아주 얕은 run에서 이미 검출되지 않은 유전자는 정규화로 되살릴 수 없어요.

정규화는 측정된 것의 눈금을 맞출 뿐, 측정 안 된 것을 만들지 못합니다.

🤔 확인 문제

얕게 읽은 자료에서 어떤 유전자의 카운트가 0 일 때 옳은 해석은?

🤔 확인 문제

깊이가 크게 다른 자료를 합칠 때 쓰는 방법이 아닌 것은?