Lesson 8 of 20

FASTQ — 네 줄이 read 하나

read 의 실제 생김새와 Phred 품질 점수

SRA 에서 파일을 받아 풀면 FASTQ 가 나옵니다. 구조는 놀랄 만큼 단순해요 — 네 줄이 read 하나입니다.

@SRR11361952.1 1 length=45          <- ① 이름 (@ 로 시작)
ATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGA      <- ② 염기 서열
+                                       <- ③ 구분자 (+ 하나)
IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIHHHHGGGEEEDDCCBA@?      <- ④ 품질 점수

둘째 줄과 넷째 줄의 길이가 같습니다. 염기 하나마다 품질 글자 하나예요.

High school네 줄이 read 하나

FASTQ는 시퀀싱 결과를 담는 표준 형식입니다. 규칙이 아주 단순해요 — 네 줄이 한 묶음입니다.

줄	내용	시작 문자
1	read의 이름	@
2	염기 서열 (ACGTN)	—
3	구분선	+
4	품질 점수 (문자로)	—

2번 줄과 4번 줄은 길이가 같아야 합니다 — 염기마다 품질 점수가 하나씩 붙습니다.

넷째 줄의 글자가 Phred 품질 점수입니다. 글자를 숫자로 바꾸는 법이 있어요.

Q = ASCII 코드 − 33

그리고 그 Q 가 틀릴 확률을 말합니다.

P(틀림) = 10^−Q/10

High school품질 점수를 왜 문자로 적나

품질 점수는 0~40 정도의 숫자입니다. 그런데 파일에는 IIIIFFF 같은 문자로 적혀 있어요.

방식	염기 하나당 크기
숫자로 "30 30 28 "	3바이트 이상
문자 하나로 "?"	1바이트

read가 수억 개니까 이 차이가 큽니다. ASCII 문자 하나가 숫자 하나를 나타내도록 약속한 거예요 — 숫자에 33을 더해 문자로 바꿉니다(Phred+33).

파일 형식의 설계는 대개 크기와의 싸움입니다.

글자 하나가 곧 확률입니다. 아주 촘촘한 표현이에요.

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# 품질 글자를 확률로 바꿉니다.
line = "IIIIIIIIIHHHHGGGEEEDDCCBA@?><;:9876543210/.-,+*)('&%$#\"!"

print(f"{'글자':>4s} {'ASCII':>6s} {'Q':>4s} {'틀릴 확률':>12s} {'천 개 중':>9s}")
for ch in "I H G E C A ? ; 5 + !".split():
    q = ord(ch) - 33
    p = 10 ** (-q / 10)
    print(f"{ch:>4s} {ord(ch):6d} {q:4d} {p:12.6f} {p*1000:8.1f}개")
print()
print("I(Q=40) 는 만 개에 하나 틀립니다.")
print("!(Q=0) 는 그냥 모른다는 뜻이에요 — 열 번에 열 번 틀립니다.")

품질은 read 안에서도 자리마다 다릅니다.

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# read 끝으로 갈수록 품질이 떨어지는 전형적인 모양.
import numpy as np

L = 150
pos = np.arange(1, L + 1)
q = 38 - 0.0009 * pos**2 - 3 * np.exp(-pos / 4)   # 앞도 조금 나쁘고 뒤는 크게 나쁘다
q = np.clip(q, 2, 41)

for p in [1, 10, 30, 60, 90, 120, 140, 150]:
    v = q[p-1]
    bar = "#" * int(v)
    err = 10 ** (-v / 10)
    print(f"{p:4d}번째 염기  Q={v:5.1f}  틀릴 확률 {err:8.5f}  {bar}")
print()
cut = int(np.argmax(q < 20)) if (q < 20).any() else L
print(f"Q20 아래로 떨어지는 지점: {cut}번째")
print("여기서부터 잘라 내는 것이 트리밍입니다.")

High schoolPhred 점수 읽기

Phred 점수 Q는 "이 염기가 틀렸을 확률"을 로그로 나타낸 것입니다.

Q = −10 × log₁₀(오류 확률)

Q	오류 확률	정확도
10	1/10	90%
20	1/100	99%
30	1/1,000	99.9%
40	1/10,000	99.99%

Q30이 흔히 쓰는 기준선입니다. "Q30 비율 90%"라는 말은 염기의 90%가 99.9% 이상 정확하다는 뜻이에요.

PAIRED 자료는 FASTQ 가 두 개입니다.

SRR11361952_1.fastq   <- 조각의 한쪽 끝
SRR11361952_2.fastq   <- 같은 조각의 다른 쪽 끝

두 파일의 n번째 read 가 서로 짝입니다. 그래서 순서를 절대 흐트러뜨리면 안 돼요. 한쪽에서 read 를 걸러 냈으면 다른 쪽에서도 같은 것을 걸러 내야 합니다.

read 하나가 순서 전체를 무너뜨립니다.

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# 짝이 어긋나면 무슨 일이 생기는가.
r1 = ["readA", "readB", "readC", "readD"]
r2 = ["readA", "readB", "readC", "readD"]

print("정상 —")
for a, b in zip(r1, r2):
    print(f"  {a} <-> {b}   {'짝' if a == b else '어긋남!'}")

r1_bad = [x for x in r1 if x != "readB"]      # 한쪽에서만 지웠다
print()
print("한쪽에서만 readB 를 지우면 —")
for a, b in zip(r1_bad, r2):
    print(f"  {a} <-> {b}   {'짝' if a == b else '어긋남!'}")
print()
print("readB 하나를 지웠는데 그 뒤가 전부 어긋났습니다.")

High school품질이 나쁜 곳은 어디인가

read 안에서도 위치마다 품질이 다릅니다. 대개 끝으로 갈수록 나빠져요.

위치	품질	왜
앞부분 몇 염기	불안정	기계가 보정 중
중간	가장 좋음	—
뒷부분	나빠짐	합성이 어긋나며 신호가 흐려짐

그래서 read 끝을 잘라 내는 트리밍이 파이프라인의 첫 단계입니다 (11강).

어댑터 서열도 잘라야 합니다. 원래 DNA 조각이 read보다 짧으면, read 끝에 어댑터가 딸려 들어와요. 그걸 안 자르면 정렬이 안 됩니다.

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FASTQ 에서 품질 글자 I(ASCII 73) 의 Phred 점수와 뜻은?

🤔 Check yourself

PAIRED FASTQ 에서 한쪽 파일에서만 read 를 지우면?