Lesson 8 of 20

자를 것인가 말 것인가 — 직접 잘라 보고 정한다

품질 트리밍 · polyA 트리밍 · 그리고 아무 효과도 없었다는 결과

RNA-seq 교과서와 블로그는 대개 이렇게 시작합니다. "먼저 Trimmomatic 이나 cutadapt 로 트리밍하세요."

정말 필요할까요? 재어 보면 됩니다. 잘라 보고, 유전자에 붙는 비율이 올라가는지 보는 것이죠. 두 가지를 잘라 봅니다.

품질 트리밍 — read 끝에서부터 Q20 미만인 염기를 잘라 낸다
polyA 트리밍 — read 끝에 붙은 A 뭉치를 잘라 낸다

High school직접 잘라 보고 정한다

인터넷의 RNA-seq 안내서는 거의 다 "먼저 트리밍하라" 고 쓴다. 그런데 이 강의는 자르고 나서 결과를 비교해 본다. 순서가 반대다.

왜 이 순서가 나은가

"항상 하라" 는 조언은 안 해도 될 때 를 알려주지 않는다. 트리밍은 공짜가 아니다. 시간이 들고, read 가 짧아지고, 짧아진 read 는 정렬이 더 어려워진다. 이득이 손해보다 큰지는 자료마다 다르다.

트리밍의 이득	트리밍의 손해
가짜 서열 제거	read 가 짧아짐
정렬률 상승 가능	짧은 read 는 여러 곳에 붙음
가짜 변이 감소	계산 시간 · 저장 공간

기본값을 따르기 전에 그 기본값이 내 자료에 맞는지 재 본다

함수 두 개. 실제 도구들이 하는 일도 크게 다르지 않습니다.

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import bu, re

def trim_quality(seq, qual, thr=20):
    "끝에서부터 Q가 thr 미만인 염기를 잘라 낸다"
    k = len(seq)
    while k > 0 and ord(qual[k-1]) - 33 < thr:
        k -= 1
    return seq[:k]

def trim_polya(seq):
    "끝에 붙은 A 열 개 이상을 잘라 낸다"
    return re.sub(r"A{10,}$", "", seq)

# 잘라 보기
h, s, q = bu.reads("WT_1", 1)[0]
print("원본      ", len(s), s)
print("품질 트리밍", len(trim_quality(s, q)), trim_quality(s, q))
print("polyA 트리밍", len(trim_polya(s)), trim_polya(s))

네 가지를 나란히 돌립니다. 판정 기준은 유전자에 붙는 비율 하나입니다.

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import bu, re

def trim_quality(seq, qual, thr=20):
    k = len(seq)
    while k > 0 and ord(qual[k-1]) - 33 < thr:
        k -= 1
    return seq[:k]

def trim_polya(seq):
    return re.sub(r"A{10,}$", "", seq)

idx = bu.index()
rs = bu.reads("WT_1")
MIN = 31                        # k-mer 길이보다 짧아지면 붙일 수가 없다

def rate(f):
    hit = short = 0
    for h, s, q in rs:
        t = f(s, q)
        if len(t) < MIN:
            short += 1
            continue
        if bu.assign(t, idx):
            hit += 1
    return hit, short

for name, f in [("자르지 않음", lambda s, q: s),
                ("품질 Q20",    lambda s, q: trim_quality(s, q)),
                ("끝 polyA",    lambda s, q: trim_polya(s)),
                ("둘 다",       lambda s, q: trim_polya(trim_quality(s, q)))]:
    hit, short = rate(f)
    print(f"{name:<12} 붙은 read {hit:>6,} ({hit/len(rs)*100:>5.2f}%)   "
          f"너무 짧아 버린 read {short:>4}")

High school두 가지 자르기

	품질 트리밍	polyA 트리밍
기준	Q 가 문턱 아래로 떨어지는 지점	A 가 연속으로 나오는 지점
자르는 곳	주로 read 끝	주로 read 끝
가정	낮은 Q = 틀린 글자	A 반복 = 정보 없음

품질 트리밍의 숨은 가정

"Q 가 낮으면 그 글자는 틀렸을 것" 이라는 가정 위에 서 있다. 그런데 Q20 이면 99% 는 맞다. 백 개 중 하나만 틀린 것을 없애려고 백 개를 다 버리는 셈이다.

이 계산 때문에 최근에는 공격적인 트리밍을 권하지 않는 흐름이 있다. 정렬 도구들이 낮은 품질 염기를 알아서 낮게 취급하기 때문이다. 자르는 대신 정보를 남겨 두고 판단은 뒤로 미루는 것이다.

일찍 버린 정보는 되찾을 수 없다 — 판단은 미룰수록 좋다

아무 효과도 없었다

26.41% → 26.41% → 26.40% → 26.38%.
자르나 안 자르나 똑같고, 오히려 0.5%의 read 를 잃습니다 (잘랐더니 31bp 보다 짧아져 버려지는 것들).

왜일까요.
① 이 자료는 품질이 좋습니다 — 3~4강에서 확인했죠. 자를 것이 별로 없습니다.
② 우리 방법은 read 안에서 맞는 k-mer 하나만 찾으면 붙입니다. 뒤쪽이 지저분해도 앞쪽이 멀쩡하면 그만입니다.

이것은 우리 장난감만의 이야기가 아닙니다. STAR 는 soft clipping 을, salmon·kallisto 는 선택적 k-mer 매칭을 합니다 — 전부 같은 이유로 "안 잘라도 된다" 는 쪽입니다.

트리밍이 필요한 경우는 따로 있습니다 — 어댑터가 10% 넘게 보이거나, 품질 곡선이 뒤에서 무너지거나, 짧은 read(50bp 이하)를 쓸 때. 이 자료는 셋 다 아닙니다.

결론이 마음에 안 들면 조건을 바꿔 다시 재 봅니다. 그래도 같으면 그것이 답입니다.

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import bu, re

# 그래도 트리밍이 이기는 경우가 있을까 — 일부러 나쁜 read 만 골라 본다
def trim_quality(seq, qual, thr=20):
    k = len(seq)
    while k > 0 and ord(qual[k-1]) - 33 < thr:
        k -= 1
    return seq[:k]

idx = bu.index()
rs = bu.reads("WT_1")

# 끝 20 글자의 평균 품질이 낮은 read 만
bad = [(h, s, q) for h, s, q in rs if sum(bu.phred(q[-20:])) / 20 < 25]
print(f"끝 20 글자 평균 Q < 25 인 read : {len(bad):,} ({len(bad)/len(rs)*100:.2f} %)")

raw = sum(1 for _, s, _q in bad if bu.assign(s, idx))
cut = sum(1 for _, s, q in bad
          if len(trim_quality(s, q)) >= 31 and bu.assign(trim_quality(s, q), idx))
print(f"  자르지 않음 {raw:>4} 붙음")
print(f"  품질 트리밍 {cut:>4} 붙음")
print()
print("나쁜 read 만 모아도 결과가 같습니다. 이 자료에서 트리밍은 할 일이 없습니다.")

High school결과: 아무 효과도 없었다

실제로 잘라 보고 정렬해 보면 — 거의 달라지지 않는다.

허탈한 결과가 아니다

이것도 결과다. 그것도 꽤 유용한 결과다. "트리밍은 이 자료에서 필요 없다" 를 증거를 갖고 말할 수 있게 되었다. 남이 그러라고 해서 안 하는 것과, 재 보고 안 하는 것은 다르다.

왜 효과가 없었는지 설명할 수 있어야 한다

이유	근거
어댑터가 애초에 0.3% 뿐	7강
품질이 전반적으로 좋음	3~4강
정렬 도구가 끝부분을 유연하게 처리	soft-clipping

결과에 이유를 붙일 수 있으면 그 결과는 다른 자료로 옮길 수 있는 지식 이 된다. "우리 자료는 어댑터가 적어서 트리밍이 무의미했다" 는 "어댑터가 많은 자료라면 의미가 있겠다" 를 함께 말해 준다.

"효과 없음" 을 설명할 수 있으면 그것은 지식이다

🎮 트리밍 실험실

품질 문턱과 최소 길이를 옮기며, 붙는 비율과 잃는 read 를 견줘 보세요.

High school그럼 트리밍은 언제 하나

상황	트리밍	이유
어댑터 비율이 높음 (>5%)	한다	인공 서열이 정렬을 막음
짧은 조각 라이브러리 (miRNA 등)	반드시 한다	read 대부분이 어댑터를 지나감
read 끝 품질이 급락	한다	가짜 변이의 원천
de novo 조립	한다	오류가 그래프를 망침
일반적 RNA-seq 정량	대개 불필요	이 강의가 보인 것

한 가지 원칙

목적이 세는 것 이면 트리밍이 덜 중요하다. 목적이 서열을 정확히 재구성하는 것 이면 중요하다. 같은 자료에 대해서도 무엇을 하려는지에 따라 전처리가 달라진다.

이 강의의 목표는 카운트 표를 만드는 것이므로 세는 쪽이다. 그래서 트리밍 없이 진행한다.

전처리는 자료의 성질이 아니라 목적에 맞춰 정한다

🤔 Check yourself

이 자료에서 트리밍이 매핑률을 올리지 못한 주된 이유는?

🤔 Check yourself

트리밍이 필요한 상황으로 알맞지 않은 것은?

🤔 Check yourself

트리밍 뒤 최소 길이(31bp) 조건을 두는 이유는?

Answer 우리 k 는 31 입니다. read 가 31bp 미만이면 k-mer 를 하나도 만들 수 없으니 무조건 못 붙죠. 실제 도구들도 같은 이유로 --minlen 을 둡니다.