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Dr. Seok's Bulk RNA-seq, First Steps

Raw data is not a table
but a heap of letters

What goes into a paper is a tidy count table. What the sequencer actually hands you is twenty-five million fragments of 76 letters.
This course joins the two up. You open real FASTQ (SRA SRR31831920–26), measure its quality, catch the ribosomal RNA that got mixed in, build a k-mer index by hand to attach reads to genes, and check the table you made against the one the paper deposited at GEO.

🐍 Python🧾 real FASTQ📉 quality curves 🦠 rRNA contamination🔑 k-mer index📊 count tables🎯 checked against the published table🇬🇧 English
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How you'll learn

🧾Handling real reads

Not a made-up example. 44,000 actual reads from SRR31831926, downloaded from SRA, come into your browser — instrument name, quality scores and contamination all exactly as they are.

🔍Digging at the odd thing until it gives

What the commonest sequence is, why there are only six distinct quality scores, why the SRA record disagrees with the instrument name — none of it gets waved past.

🔑An aligner in eight lines

A k-mer index, the reverse complement, first match. You write the skeleton of what salmon does yourself and attach 44,000 reads to 290 genes.

⚖️Working out full marks, then marking

“Is r = 0.76 a good score?” cannot be answered as it stands. Only after a simulation shows the ceiling is 0.91 can you call it 84%.

Full curriculum

01
원자료는 표가 아니라 글자 더미다
FASTQ 네 줄의 구조 · 2,500만 개의 76 글자
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02
read 이름이 말해 주는 것 — 그리고 메타데이터가 틀렸다
기기 · 플로우셀 · 레인 · 타일 · 좌표 · 그리고 SRA 기록과의 불일치
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03
품질 점수 — 글자 하나가 확률 하나
Phred 점수와 ASCII · 그리고 이 자료의 품질이 여섯 가지뿐인 이유
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04
위치별 품질 — 어디서부터 나빠지는가
76 자리의 평균 품질 곡선 · N 은 어디에 몰리나
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05
똑같은 read 가 자꾸 나온다 — 중복 37%
PCR 중복인가 진짜 발현인가 · RNA-seq 에서 중복을 지우면 안 되는 이유
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06
가장 흔한 서열의 정체 — read 다섯 개 중 하나가 리보솜
45S rDNA 에서 그 자리를 찾아낸다 · 왜 돈을 20% 버렸나
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07
read 끝에 붙은 것들 — 어댑터와 polyA 꼬리
어댑터는 0.3% 뿐인데 polyA 는 20% · 무엇이 진짜 문제인가
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08
자를 것인가 말 것인가 — 직접 잘라 보고 정한다
품질 트리밍 · polyA 트리밍 · 그리고 아무 효과도 없었다는 결과
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09
read 를 유전자에 붙이는 두 가지 길
게놈 정렬(STAR)과 유사정렬(salmon) · 왜 브라우저에서도 되는가
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10
k-mer 색인을 직접 짓는다
31 글자로 자르고 사전에 담는다 · 왜 하필 31인가
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11
가닥 — 역상보를 잊으면 절반을 잃는다 (이 자료는 아니지만)
라이브러리가 가닥 정보를 지켰는지 자료에서 직접 알아낸다
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12
44,000 read 를 290 유전자에 붙인다
붙이는 함수를 짜고 · 어느 유전자인지 정할 수 없는 read 를 만난다
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13
이름이 안 맞는다 — 상위 300개 중 16개를 못 찾았다
바뀐 유전자 이름 · 다른 파일에 있는 것 · 참조에 아예 없는 것
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14
카운트 표를 만들고 공개 표와 맞춰 본다
우리 손으로 만든 290 × 7 · 그리고 r = 0.76
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15
깊이가 정확도를 만든다 — 왜 2,700만 개를 읽는가
500 개에서 20,000 개까지 · 그리고 Ddx54 는 끝내 안 보인다
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16
긴 유전자가 read 를 더 받는다 — 그런데 나누면 더 나빠졌다
TPM · FPKM 이 무엇을 고치는가 · 그리고 언제 쓰면 안 되는가
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17
우리가 낼 수 있었던 최고점 — 천장을 계산한다
뽑기 잡음만으로 정해지는 상한 0.91 · 우리는 0.76, 즉 그 84%
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18
진짜 파이프라인은 무엇을 더 하나
STAR · salmon · featureCounts 가 우리 여덟 줄에 더하는 것들
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19
판정 — 우리가 만든 표는 쓸 만한가
할 수 있는 것과 할 수 없는 것을 줄마다 적는다
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20
원자료를 받으면 처음 할 일
20강에서 만든 도구 · 점검 목록 · 다음 걸음
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