7강 / 20강

나쁜 세포를 골라낸다 — 문턱은 어떻게 정하는가

총 UMI · 검출 유전자 수 · 미토콘드리아 비율

1강에서 우리가 받은 것은 filtered 행렬이라고 했습니다. 그런데 그 "filtered" 는 "물방울에 세포가 들어 있었는가" 만 걸러 낸 것입니다. 그 세포가 쓸 만한가는 전혀 다른 문제예요.

단일세포 실험에서 흔히 섞여 들어오는 불량품은 세 종류입니다.

💧

빈 껍데기

세포가 터져 나가고 주변 RNA만 담긴 방울 → 총 UMI 가 아주 낮다

☠️

죽어 가는 세포

세포막이 새어 mRNA 가 빠져나가고 미토콘드리아만 남는다 → 미토 % 가 높다

👥

이중세포

한 방울에 세포 두 개 → UMI 와 유전자 수가 비정상적으로 많다

그래서 세포마다 세 가지 숫자를 잽니다. 총 UMI, 검출된 유전자 수, 미토콘드리아 유전자의 비율. 이 세 가지가 단일세포 QC 의 기본 삼종 세트입니다.

고등학생나쁜 세포를 골라낸다

지표	낮으면	높으면
총 UMI	빈 방울 · 죽은 세포	이중세포 의심
검출 유전자 수	같음	같음
미토콘드리아 비율	—	죽어 가는 세포

양쪽 끝을 다 자릅니다 — 너무 적어도, 너무 많아도 문제예요.

미토콘드리아 유전자 접두사는 종에 따라 다릅니다. 생쥐 mt-, 사람 MT-. 이걸 틀리면 미토 % 가 전부 0 으로 나와요.

Python 브라우저에서 실행

# 세 지표를 한 번에 계산합니다.
import h5py, numpy as np, pandas as pd, scipy.sparse as sp

with h5py.File("GSE268555_slice.h5", "r") as f:
    m = f["matrix"]
    X = sp.csc_matrix((m["data"][:].astype(np.float32), m["indices"][:], m["indptr"][:]),
                      shape=tuple(m["shape"][:]))
    이름 = np.array([x.decode() for x in m["features"]["name"][:]])
    표본 = np.array([x.decode() for x in m["sample"][:]])
    바코드 = np.array([x.decode() for x in m["barcodes"][:]])

총UMI   = np.asarray(X.sum(0)).ravel()
유전자수 = np.diff(X.indptr)

미토 = np.char.startswith(이름, "mt-")          # 생쥐는 소문자 mt-, 사람은 대문자 MT-
리보 = np.char.startswith(이름, "Rps") | np.char.startswith(이름, "Rpl")
미토퍼센트 = np.asarray(X[미토].sum(0)).ravel() / np.maximum(총UMI, 1) * 100
리보퍼센트 = np.asarray(X[리보].sum(0)).ravel() / np.maximum(총UMI, 1) * 100

qc = pd.DataFrame({"총UMI": 총UMI.astype(int), "유전자수": 유전자수,
                   "미토%": 미토퍼센트.round(2), "리보%": 리보퍼센트.round(2),
                   "표본": 표본}, index=바코드)
print(qc.describe().round(1).to_string())
print("\n표본별 중앙값")
print(qc.groupby("표본")[["총UMI", "유전자수", "미토%"]].median().round(2).to_string())

고등학생미토콘드리아 비율이 왜 지표인가

세포가 죽어 가면 막이 새고 세포질 RNA가 빠져나갑니다.

RNA 위치	막이 새면
세포질	빠져나감
미토콘드리아 안	남음 — 자기 막이 있으니
결과	미토콘드리아 비율이 올라감

미토콘드리아가 늘어난 게 아니라 나머지가 빠져나간 것입니다.

미토 86.7% 짜리 세포가 있습니다 — 완전히 죽어 버린 세포예요. 이런 것이 섞이면 뒤의 군집이 통째로 오염됩니다.

Python 브라우저에서 실행

# 문턱을 정하고 실제로 걸러 봅니다.
import h5py, numpy as np, pandas as pd, scipy.sparse as sp

with h5py.File("GSE268555_slice.h5", "r") as f:
    m = f["matrix"]
    X = sp.csc_matrix((m["data"][:].astype(np.float32), m["indices"][:], m["indptr"][:]),
                      shape=tuple(m["shape"][:]))
    이름 = np.array([x.decode() for x in m["features"]["name"][:]])
    표본 = np.array([x.decode() for x in m["sample"][:]])

총UMI = np.asarray(X.sum(0)).ravel()
유전자수 = np.diff(X.indptr)
미토퍼센트 = np.asarray(X[np.char.startswith(이름, "mt-")].sum(0)).ravel() / np.maximum(총UMI,1) * 100

MIN_UMI, MIN_GENE, MAX_MITO = 1000, 500, 10.0
통과 = (총UMI >= MIN_UMI) & (유전자수 >= MIN_GENE) & (미토퍼센트 < MAX_MITO)

print(f"전체 {len(통과):,}개 → 통과 {통과.sum():,}개 ({통과.mean()*100:.1f}%)")
print(f"   UMI 부족   {(총UMI < MIN_UMI).sum():4d}개")
print(f"   유전자 부족 {(유전자수 < MIN_GENE).sum():4d}개")
print(f"   미토 과다   {(미토퍼센트 >= MAX_MITO).sum():4d}개   (가장 높은 세포 {미토퍼센트.max():.1f}%)")

print("\n표본별 통과율")
for s in ["WT_CTRL", "KD_CTRL", "WT_PD1", "KD_PD1"]:
    mm = 표본 == s
    print(f"   {s:9} {통과[mm].sum():3d}/{mm.sum():3d}  ({통과[mm].mean()*100:.0f}%)")

Xf = X[:, 통과]
print("\n걸러 낸 뒤 행렬:", Xf.shape)

고등학생문턱을 어떻게 정하나

방법	내용
고정 문턱	MT < 10%, 유전자 > 200 — 편하지만 조직에 안 맞을 수도
분포 기반	중앙값 ± 3 MAD — 자료에 맞춤
그림을 보고	히스토그램·산점도에서 골짜기

심장·근육·간은 미토콘드리아가 원래 많습니다 — 20~30%도 정상일 수 있어요.

문턱은 어디서 오는가 — 정답이 없다는 것이 정답

학생들이 가장 많이 하는 질문입니다. "왜 하필 1000, 500, 10% 인가요?" 정직하게 답하면 관습과 눈대중입니다. 그리고 그것이 이 분야의 실제 모습이에요.

기준	흔히 쓰는 값	근거
총 UMI	500 ~ 1,000 이상	이보다 낮으면 신호 대 잡음이 무너진다
검출 유전자	200 ~ 500 이상	Seurat 기본 튜토리얼이 200을 쓴다
미토 %	5 ~ 20% 미만	조직마다 다르다. 심근·간은 원래 높다

중요한 것은 고른 값이 아니라 고른 이유를 적어 두는 것입니다. 그리고 문턱을 바꿔 봤을 때 결론이 뒤집히는지 확인하는 일이에요. 결론이 문턱에 따라 뒤집힌다면, 그 결론은 애초에 약한 것입니다.

논문의 QC 를 그대로 따라 해 봤습니다 — 숫자가 안 맞습니다

이 논문의 부록에는 QC 기준이 이렇게 적혀 있습니다.

cells with detected genes fewer than 200 … were eliminated cells containing more than 5% mitochondrial transcripts … were also removed After a quality control, we identified 29,343 immune cells

그래서 GEO 에 올라온 네 파일에 똑같은 기준을 적용해 봤습니다. 결과는 38,469개. 논문이 말한 29,343개와 9,126개나 차이가 납니다.

논문이 틀렸다는 뜻은 아닙니다. 이중세포 제거를 더 했거나, 어떤 군집을 통째로 뺐거나, raw 행렬에서 세포 판정을 다시 했을 수 있어요. 다만 부록에 적힌 대로만 해서는 그 숫자에 닿을 수 없다는 것, 이것이 재현 연구를 해 보면 거의 언제나 만나는 현실입니다.

그래서 여러분이 논문을 쓸 때는 숫자가 아니라 코드를 공개하세요.

고등학생이미 filtered인데 왜 또 거르나

1강에서 우리가 받은 것은 filtered 행렬이라고 했습니다. 그럼 이미 걸러진 것 아닌가요?

Cell Ranger가 한 것	우리가 하는 것
바코드가 세포인가 빈 방울인가	그 세포가 쓸 만한가
UMI 총량 기준	미토콘드리아·유전자 수

"세포다"와 "좋은 세포다"는 다른 판정입니다.

🤔 확인 문제

미토콘드리아 유전자 비율이 높은 세포를 버리는 이유는?

🤔 확인 문제

생쥐 자료에 사람용 코드 startswith("MT-") 를 그대로 썼습니다. 무슨 일이 벌어질까요?

🤔 확인 문제

QC 문턱을 정하는 올바른 태도는?