8강 / 20강

무릎 그래프 — 남이 이미 내린 결정을 알아본다

barcode rank · raw 와 filtered 의 차이 · 주변 RNA

10x 실험을 그림으로 그리면 이렇습니다. 세포 현탁액과 바코드 구슬을 기름에 흘려 넣어 물방울 수십만 개를 만듭니다. 이상적으로는 방울 하나에 세포 하나 + 구슬 하나. 그런데 실제로는 대부분의 방울이 비어 있습니다.

그러면 CellRanger 는 어떻게 "이 방울엔 세포가 있다" 고 판정할까요? UMI 개수로 줄을 세웁니다. 많이 잡힌 바코드부터 순서대로 늘어놓고 로그-로그 그래프를 그리면 어느 지점에서 뚝 떨어지는 무릎이 나타납니다. 그 앞이 세포, 뒤가 빈 방울이에요.

고등학생남이 이미 내린 결정을 알아본다

무릎 그래프는 바코드를 UMI 수 순으로 줄 세워 그린 것입니다.

구간	정체
왼쪽 평평	진짜 세포
급강하 (무릎)	경계
오른쪽 긴 꼬리	빈 방울

filtered 파일은 무릎 왼쪽만 담은 것입니다 — 누군가 선을 그은 결과예요.

그런데 이 그림에는 무릎이 없습니다. 왜일까요? — 다음 설명을 보세요.

Python 브라우저에서 실행

# 우리 조각으로 무릎 그래프를 그려 봅니다.
import h5py, numpy as np, scipy.sparse as sp
import matplotlib.pyplot as plt

with h5py.File("GSE268555_slice.h5", "r") as f:
    m = f["matrix"]
    X = sp.csc_matrix((m["data"][:].astype(np.float32), m["indices"][:], m["indptr"][:]),
                      shape=tuple(m["shape"][:]))
    표본 = np.array([x.decode() for x in m["sample"][:]])

총UMI = np.asarray(X.sum(0)).ravel()

plt.figure(figsize=(7, 4.6))
for s in ["WT_CTRL", "KD_CTRL", "WT_PD1", "KD_PD1"]:
    v = np.sort(총UMI[표본 == s])[::-1]
    plt.plot(np.arange(1, len(v)+1), v, label=s)
plt.xscale("log"); plt.yscale("log")
plt.xlabel("barcode rank"); plt.ylabel("total UMI")
plt.title("barcode rank plot (filtered matrix only)")
plt.legend(); plt.grid(alpha=.3)

고등학생raw가 있어야 볼 수 있다

파일	무릎 그래프를 그릴 수 있나
raw	가능 — 모든 바코드가 있음
filtered	불가 — 이미 잘렸음

filtered만 받으면 그 결정이 옳았는지 확인할 수 없습니다.

그래서 자료를 공개할 때는 raw도 함께 올리는 것이 좋습니다.

고등학생주변 RNA

빈 방울에도 UMI가 조금 있습니다. 왜일까요?

단계	일어나는 일
세포를 흩을 때 일부가 터짐	RNA가 용액으로
모든 방울에 그 용액이 들어감	—
결과	모든 바코드에 배경이 깔림

18강에서 "CD45⁺ 세포에서 Epcam이 검출되는" 이유가 이것입니다.

물려받은 결정의 목록

GSE268555 를 받는 순간 우리는 이미 다음 결정들을 함께 받았습니다.

✔참조 유전체 — mm10 (더 최신인 GRCm39 가 아니라)

✔정렬·정량 프로그램 — CellRanger (파일 속성에 따르면 7.0.1)

✔세포 판정 — CellRanger 의 EmptyDrops 계열 알고리즘

✔인트론 포함 여부 — 버전마다 기본값이 다르다

✔세포 분리 방법 — Aria Fusion 으로 CD45⁺ 만 선별

마지막 항목이 특히 큽니다. CD45⁺ 만 골라 냈으므로 이 자료에는 암세포가 거의 없습니다. "종양 안에 면역세포 비율이 얼마인가" 같은 질문은 이 자료로는 답할 수 없어요. 분모가 이미 면역세포로 고정되어 있으니까요. 논문이 그 질문에 답하려고 공간전사체(Xenium) 를 따로 쓴 이유가 이것입니다.

Epcam(상피)·Col1a1(섬유아세포)이 0%가 아닙니다. 세포가 터지며 흘러나온 RNA 가 모든 물방울에 조금씩 섞여 들어간 것 — 이것이 주변 RNA 오염입니다.

Python 브라우저에서 실행

# 주변 RNA(ambient RNA) 흔적 찾기 — 있어서는 안 될 곳에 있는 유전자.
import h5py, numpy as np, scipy.sparse as sp

with h5py.File("GSE268555_slice.h5", "r") as f:
    m = f["matrix"]
    X = sp.csc_matrix((m["data"][:].astype(np.float32), m["indices"][:], m["indptr"][:]),
                      shape=tuple(m["shape"][:]))
    이름 = np.array([x.decode() for x in m["features"]["name"][:]])

def 검출률(g):
    i = np.where(이름 == g)[0]
    if not len(i): return None
    v = np.asarray(X[int(i[0])].todense()).ravel()
    return (v > 0).mean() * 100

print("CD45⁺ 로 골라 낸 면역세포인데, 다른 계통 유전자가 얼마나 섞여 있나")
for g in ["Ptprc", "S100a8", "Epcam", "Krt8", "Col1a1", "Pecam1", "Hba-a1"]:
    r = 검출률(g)
    print(f"   {g:8} {r:5.1f}% 의 세포에서 검출" if r is not None else f"   {g:8} (없음)")

고등학생판정이 어려운 경우

상황	문제
세포 크기 차이가 큼	작은 세포가 빈 방울처럼
주변 RNA가 많음	경계가 흐림
죽어 가는 세포가 많음	UMI가 적음

무릎이 뚜렷할수록 좋은 자료입니다 — 흐릿하면 시료 품질을 의심하세요.

🤔 확인 문제

무릎 그래프(barcode rank plot)에서 '무릎'의 왼쪽과 오른쪽은 각각 무엇인가요?

🤔 확인 문제

우리가 받은 filtered 행렬로 무릎 그래프를 그렸더니 무릎이 안 보였습니다. 왜일까요?

해설 무릎은 세포와 빈 방울의 경계에서 생깁니다. 빈 방울이 이미 잘려 나간 자료에는 경계 자체가 없어요. 진짜 무릎을 보려면 raw_feature_bc_matrix 가 필요합니다.

🤔 확인 문제

이 자료가 CD45⁺ 선별을 거쳤다는 사실이 해석에 주는 제약은?