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mRNA 백신을 상자 하나에서 만들 수 있는가 — DNA 주형을 넣으면 여덟 시간 뒤 지질나노입자가 나오는 통합 플랫폼

Microsystems & Nanoengineering · doi:10.1038/s41378-023-00538-8

cc-by-4.0

초록

백신은 다양한 질병으로부터 인간을 보호하기 위해 사용됩니다. mRNA 백신은 개발 과정을 단순화하고 기존 백신의 생산 비용을 낮춰 코로나19와 같은 급성 및 중증 질병에 신속히 대응할 수 있게 합니다. 본 연구에서는 DNA 템플릿으로부터 직접 mRNA 제품을 간소화하고 필요 시 즉시 제조할 수 있는 범용 통합 플랫폼을 구축했습니다. 목표 DNA 템플릿은 체외에서 중합효소 연쇄반응(PCR) 모듈로 증폭된 뒤 mRNA 서열로 전사되며, 이 mRNA는 자기식으로 정제되고 지질 나노입자에 캡슐화되었습니다. 초기 예제로 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP)을 사용하여 플랫폼을 테스트했습니다. 제품의 발현 능력과 효율은 HEK‑293T 세포에 형질전환하여 평가했습니다. 배치 생산량은 8시간에 200–300 μg의 eGFP mRNA로 추정되었습니다. 또한, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS‑CoV‑2) 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD)을 암호화한 mRNA 백신도 이 플랫폼으로 생산되었습니다. 제안된 통합 플랫폼은 범용 및 필요 시 즉시 mRNA 제품을 제조하는 데 장점을 보여주며, mRNA 기술에 대한 폭넓은 접근성을 촉진하고, 팬데믹 상황에서 새로운 mRNA 기반 백신의 신속한 공급 및 종양학과 만성 감염 질환(예: 바이러스성 간염 및 후천성 면역 결핍 증후군) 등에 대한 개인 맞춤형 mRNA 기반 치료제 개발을 가능하게 할 잠재력을 제공합니다.

서론

2019년 12월 발생 이후, 코로나바이러스 질환 2019(COVID‑19)는 전 세계에 막대한 손실을 초래했습니다¹. 대규모 예방접종 캠페인은 팬데믹을 억제하고 사망률을 낮추는 핵심으로 여겨집니다. 불활성화 백신, 재조합 서브유닛 백신, 아데노바이러스 벡터 백신, mRNA 백신 등을 포함한 예방 백신 개발을 위해 큰 노력이 기울여졌습니다. 여러 백신이 이미 대규모 사용에 들어섰으며 실제 데이터가 보고되었습니다^2–7. 2022년 10월 11일 기준, 전 세계적으로 총 12,788,955,639회 투여가 이루어졌습니다(https://covid19.who.int/). 기존 백신의 제조 공정은 병원체마다 생산 및 정제 과정이 달라 각 질병에 맞게 맞춤화되어야 합니다. 따라서 COVID‑19와 같은 신흥 전염병에 대한 안전하고 효과적인 백신을 개발하는 데는 비용이 많이 들고 복잡하며 시간이 많이 소요되어 긴급한 유행에 신속히 대응하기 어렵습니다^8,9. 그러나 최근 핵산 백신의 등장으로 이러한 상황에 혁신적인 아이디어가 제공되었습니다¹⁰. 핵산 백신은 기존 백신보다 개발에서 생산까지 걸리는 시간이 짧아 효과적인 “필요 시 즉시” 유행 및 팬데믹 대응에 더 적합합니다¹¹.

여러 DNA 또는 mRNA 백신이 직접 주입하거나 전달 시스템을 통해 감염성 질환 또는 암에 대한 예방 및 치료 목적으로 투여되었습니다^12,13. 그러나 DNA 백신은 돌연변이 위험 때문에 일반적으로 안전성이 낮다고 여겨집니다¹⁴. 반면 mRNA는 세포질에서 단백질로 번역되며 유전자 삽입 위험이 없습니다¹⁵. 또한 mRNA는 인간 몸의 대부분 생화학적 과정에 관여하여 유전 정보를 다수의 단백질에 전달합니다. 따라서 mRNA는 바이러스, 곰팡이, 박테리아 및 자가면역 질환; 알레르기; 종양 등을 대상으로 하는 다목적 백신 플랫폼으로 개발될 수 있습니다^11,16–21. 지난 수십 년간 mRNA 백신의 안정성, 생체 적합성, 생물 보안성 및 전달 벡터 분야에서 눈부신 성과가 이루어졌으며, 현재는 감염성 질환에 대한 예방 백신 및 암 면역 치료를 위한 치료 백신으로 유망하게 평가되고 있습니다^22,23. mRNA 백신은 다수의 에피토프가 I형 및 II형 주요 조직 적합성 복합체에 제시되어 세포성 및 체액성 면역 반응을 더욱 강하게 유도할 수 있습니다²⁴. 또한 동물 모델 및 인간 임상시험, 실제 데이터에서 관찰된 효과적이고 장기적이며 안전한 면역 반응을 통해 그 전망이 확인되었습니다^25,26. mRNA 백신은 신속한 대응과 간단한 제조라는 장점으로 COVID‑19 백신 경쟁에서 큰 우위를 보였습니다^27–30. 2020년 12월, 미국 식품의약국(FDA)은 COVID‑19에 대한 두 가지 mRNA 백신(모더나[미국 케임브리지]와 화이자/바이오엔테크[미국 뉴욕/독일 마인츠])에 대해 긴급 사용 승인을 내렸습니다^31–33. 모더나의 mRNA‑1273 백신은 중증 사례를 포함해 COVID‑19 발병을 94.1% 예방하는 효능을 보였습니다³⁴. 이스라엘의 실제 연구에서는 화이자/바이오엔테크의 BNT162b2 두 차례 접종이 모든 연령대에서 다양한 SARS‑CoV‑2 결과에 대해 효과적임을 밝혔습니다³⁵. COVID‑19 팬데믹 대응에 mRNA 백신이 성공적으로 적용된 사례는 이 기술의 거대한 잠재력을 입증했습니다.

mRNA는 현재 in vitro transcription (IVT)을 통해 생산되며, 이는 다재다능하고 성숙한 기술^36,37이다. 이 생산 과정은 서열에 독립적이며, 비교적 작은 조정으로 유사한 크기의 거의 모든 mRNA 분자를 생산하는 데 사용할 수 있다. 공개된 정보에 따르면, Pfizer/BioNTech는 인간 세포가 코로나바이러스 단백질을 만들고 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하도록 하는 유전 지시를 포함한 플라스미드에서 BNT162b2 백신을 생산하였다. DNA 템플릿 바이알을 수확한 후, mRNA 가닥이 전사되고 정제되어 lipid nanoparticle (LNP)으로 캡슐화되었다. 또는 mRNA는 전사 시작 부위에 위치한 박테리오파지 RNA 중합효소 프로모터가 장착된 polymerase chain reaction (PCR) 증폭 cDNA 템플릿으로부터 생성될 수 있다. 캡 아날로그는 재조합 효소를 사용하여 전사와 동시에 또는 전사 후에 mRNA의 5′ 말단에 추가되어야 한다. DNA 오염을 제거하기 위해 DNase에 의한 DNA 소화가 필요하다. 그런 다음 E. coli poly(A) polymerase에 의해 mRNA의 3′ 말단에 poly(A) 꼬리가 추가되어 mRNA를 더욱 안정화한다³⁸. 정제 및 lipid 벡터와의 캡슐화 후, mRNA 백신은 추가 최적화 및 적용을 위한 테스트가 준비된다. mRNA 제조 과정에서는 RNase를 신중히 피해야 하는데, 이는 mRNA 수율을 크게 감소시킬 수 있기 때문이다⁹. 이 제조 과정은 명백히 자동화될 수 있다. 또한 자동화된 통합 mRNA 준비 플랫폼은 mRNA 연구 및 개발에 강력한 도구가 될 수 있으며, mRNA 백신 및 mRNA 기반 약물과 같은 제품을 제공한다. 그러나 자동화된 mRNA 준비 플랫폼에 대한 보고는 거의 없다. 디지털-바이오 로지컬 컨버터 (DBC)는 DNA 템플릿, RNA 분자, 단백질, 바이러스 입자와 같은 생물학적 제제를 “on demand”로 생산할 수 있어 다양한 응용에 적응하기에 강력하지만, 부피가 크다³⁹. 전사와 번역 단계의 개별 생화학적 요구를 별도 구역에서 다루는 자동화 마이크로플루이딕 시스템도 개발될 수 있다⁴⁰. 그러나 마이크로플루이딕 장치의 단점은 제한된 반응 부피와 다양성 부족이다. 따라서 긴급한 전염병 문제와 개인 맞춤형 치료에 신속히 대응하기 위한 자동화 “on-demand” mRNA 준비 플랫폼이 여전히 시급히 필요하다.

본 연구에서는 mRNA 제품의 간소화되고 on‑demand 준비를 위한 보편적인 통합 플랫폼과 해당 제어 시스템을 보고한다. 이 플랫폼은 세 가지 주요 구성 요소로 이루어졌다: (1) 목표 DNA 템플릿을 증폭하는 PCR 모듈; (2) IVT를 위한 열‑자기 분리‑혼합 (HMM) 모듈로, 열안정적이며 자기적으로 분리 가능한 반응 성분을 혼합하는 플랫폼을 제공; (3) staggered herringbone micromixer (SHM) 마이크로플루이딕 칩을 이용해 mRNA를 직접 LNP로 캡슐화하는 LNP 모듈. 구체적으로, mRNA의 자동 생산은 사용자의 특정 요구에 맞게 맞춤화된 일련의 워크플로 파일을 통해 수행되었다. 본 작업에서는 enhanced green fluorescent protein (eGFP)를 초기 예제로 삼아 세척, 자체 테스트, PCR 증폭, 캡핑을 포함한 IVT, DNA 소화, poly(A) tailing, 정제 등 워크플로 파일 그룹을 개발하였다. 통합 플랫폼은 이후 eGFP mRNA 생산 및 LNP 캡슐화를 위한 PCR 및 IVT 반응을 수행하는 데 활용되었다. 또한 이 플랫폼을 이용해 SARS‑CoV‑2 RBD‑mRNA 백신을 생산하였다. SARS‑CoV‑2 RBD 단백질 발현에 대한 Western blot 분석은 이 플랫폼의 실용성을 나타냈다. 제안된 통합 플랫폼은 보편적이고 유연하며 자동화된 mRNA 제품 준비에 장점을 보여주며, mRNA 기술에 대한 광범위한 접근을 촉진하고 mRNA 제품 개발을 가능하게 할 잠재력을 가진다.

실험 섹션

중합효소 연쇄반응(PCR)

PCR 혼합물은 LA Taq 10 U (Takara, Beijing, China), 10× LA Taq buffer II (Mg²⁺ Plus), dNTP 혼합물 (각 200 nM), 4.8 ng DNA 템플릿, Prime F 및 R (각 200 nM), 그리고 200 μL까지의 nuclease‑free water를 포함한다. 프라이머는 Sangon Biotech (Shanghai, China)에서 합성하였다. 반응 조건은 95 °C에서 5분; 30 사이클 동안 95 °C 40 s, 58 °C 45 s, 72 °C 60 s; 그리고 최종 연장 단계는 72 °C에서 10분이었다. DNA 생성물은 1% agarose TAE 겔 전기영동으로 정성적으로 검출하였다. 이후, 대량의 DNA는 NaCl (0.72 M), Tris‑HCl (20.0 mM, pH 7.5), EDTA (1.0 mM)를 포함한 1 mL 버퍼에서 30 °C에서 45분 동안 친수성 코팅된 streptavidin 마그네틱 비드 (New England Biolabs, Ipswich, USA)에 의해 포획되었다.

시험관 내 전사(IVT)

IVT 반응 혼합물에는 T7 폴리머라제 효소 혼합물(Promega, Madison, USA) 20 µL; 5× 완충액; rATP, rCTP, rUTP 각각 1.875 mM; rGTP 0.225 mM, cap analog 0.375 mM(Promega, Madison, USA), 이전 단계에서 친수성 코팅된 스트렙타비딘 마그네틱 비드에 의해 포획된 선형 DNA, 그리고 nuclease-free 물을 총 200 µL가 되도록 포함하였다. 혼합물을 37 °C에서 2 h 배양하였다. 이어서 RQ1 RNase-free DNase 효소(Promega, Madison, USA) 10 U를 추가하여 DNA 템플릿을 37 °C에서 추가로 15 min 소화시켰다. 그 후, 이전 단계의 혼합물 200 μL에 E-PAP(Fisher Scientific 또는 Invitrogen, Gibco, USA) 40 U, 5× E-PAP 완충액, MnCl₂ 2.5 mM, ATP 1 mM, 그리고 nuclease-free 물을 총 400 μL가 되도록 넣고 37 °C에서 1 h 반응시켰다. Oligo d(T) 25‑코팅 마그네틱 비드(New England Biolabs, Ipswich, USA)를 사용하여 oligo d(T)와 poly(A) 꼬리의 특이적 결합을 통해 mRNA 제품을 정제하였다. 간단히 말하면, 40.0 mM Tris‑HCl(pH 7.5), 1.6 M LiCl, 2.0 mM EDTA 3.2 μL, 그리고 RNase inhibitor 0.5 U/μL을 포함한 결합 완충액 100 μL를 사용하여 oligo d(T) 25‑코팅 마그네틱 비드 200 μL를 한 번 세척하고 비드를 재현탁하였다. 65 °C에서 5 min 배양한 뒤, mRNA 제품을 즉시 비드와 혼합하여 실온에서 5 min 반응시켰다. 다음으로 상층액을 제거하고, 세척 완충액(10.0 mM Tris‑HCl(pH 7.5), 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA, RNase inhibitor 0.5 U/μL) 200 μL로 비드를 두 번 세척하였다. 마지막으로 nuclease-free 물 200 μL를 사용하여 정제된 mRNA를 용출하였다. 합성된 mRNA의 품질과 농도는 Agilent 2100 Bioanalyzer와 RNA Nano 6000 Assay Kit(Agilent)를 이용해 확인하였다. 특별히 언급되지 않은 경우 모든 용액 준비에 DEPC 처리 물(0.1%)을 사용하였다. 모든 원심관은 고압멸균했으며, 모든 표면은 RNase Zap(Fisher Scientific, Gibco, USA)와 0.1% DEPC 처리 물로 처리하여 가능한 RNase 오염을 제거하였다.

LNP 캡슐화(LNP encapsulation)

Fluigent(France)에서 제공한 결합 압력 조절기(Flow EZ, 0–2000 mbar)와 흐름 모니터링 모듈(FLOW UNIT, 0–1000 μL/min)을 사용하여 LNP 캡슐화 과정(LNP encapsulation process)에서 일정한 흐름을 제어하였다. Ibiochips에서 구매한 SHM 마이크로플루이딕 칩을 빠른 혼합 과정에 적용하였다. LNP의 이미지는 투과 전자 현미경(Hitachi H-7650, Japan)을 통해 촬영하였다. LNP의 동적 광산란(DLS) 분포는 Nano‑Lab Zeta Sizer(Malvern, UK)^41,42를 이용해 특성화하였다.

in vitro 형질전환(in vitro transfection)

HEK‑293T(ATCC, CRL‑3216) 세포를 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(Thermo Fisher Scientific)와 10 % fetal bovine serum(Thermo Fisher Scientific), 1 % 항생제(페니실린 100 U/mL, 스트렙토마이신 100 μg/mL, Thermo Fisher Scientific)으로 배양한 뒤, 전사된 mRNA의 품질을 추가로 평가하기 위해 mRNA‑LNP 복합체로 in vitro 형질전환(in vitro transfection)하였다. 형질전환 1일 전, 세포를 12‑well 플레이트에 웰당 3 × 10⁵ 개의 밀도로 파종하였다. mRNA‑LNP 복합체를 세포에 1 μg/웰씩 첨가하였다. 단백질 발현은 형질전환 후 24 h에 검출하였다. eGFP mRNA를 적용하면 Olympus IX71 형광 현미경 아래에서 녹색 형광 단백질 발현을 관찰했으며, 이미지는 DP controller 소프트웨어로 획득하였다. 반면 SARS‑CoV‑2‑mRNA를 적용하면 SARS‑CoV‑2 RBD 단백질 발현을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 상업용 Precision Nanosystems Ignite(Vancouver, British Columbia, Canada)에서 생산된 mRNA‑LNP를 양성 대조군으로 사용하였다.

결과 및 고찰(Results and discussion)

플랫폼의 시스템 설계(System design of the platform)

통합 “template‑in vaccines‑out”(템플릿‑인 백신‑아웃) 플랫폼을 설계하여 mRNA 백신을 편리하게 준비할 수 있게 하였으며, 이는 긴급한 전염병 문제와 개인 맞춤 치료에 신속히 대응할 수 있는 자동화된 “on‑demand”(온‑디맨드) mRNA 제조 장치의 요구를 충족한다. 이 시스템에 적용된 mRNA 생산 과정은 PCR, IVT(체외 전사), DNA 템플릿 소화, poly(A) 꼬리 추가(poly(A) tailing), mRNA 전사체 정제, 그리고 LNP 캡슐화(LNP encapsulation)를 포함하며, Fig. 1a에示되어 있다. 목표 백신이 시퀀싱 또는 바이오인포매틱스에 의해 결정되면, 템플릿을 비번역 영역(UTRs)과 관심 유전자(GOI)를 포함하도록 설계할 수 있다. 여러 차례의 PCR 증폭 후, 대량의 DNA 템플릿을 친수성 코팅 스트렙타비딘 마그네틱 비드로 포획한다. 이후 IVT 반응 혼합물을 도입하여 몇 시간 동안 IVT(체외 전사)를 수행한다. 그 다음 DNA 템플릿을 DNase로 분해한다. 이어서 poly(A) polymerase를 이용해 RNA 전사체에 ≥150 베이스의 poly(A) 꼬리를 추가한다. 다음으로 oligo d(T) 25‑코팅 마그네틱 비드로 mRNA 제품을 농축한다. 용출 및 LNP 캡슐화(LNP encapsulation)를 수행하면 mRNA 백신이 사용 준비가 된다. Figure 1b는 mRNA 준비를 위한 통합 “template‑in vaccines‑out”(템플릿‑인 백신‑아웃) 플랫폼의 액체 흐름도를 보여준다. 모든 시약을 별도로 로드했기 때문에 전체 실험 동안 교차 오염을 방지할 수 있었다. 실험 후 사용된 저장 유닛을 폐기하고, 모든 시약은 폐기물 저장소에 보관하였다.Fig. 1System design of the platform.a 이 시스템에 적용된 mRNA 생산 과정의 개요로, PCR, IVT(체외 전사), DNA 템플릿 소화, poly(A) 꼬리 추가(poly(A) tailing), mRNA 전사체 정제, 그리고 LNP 캡슐화(LNP encapsulation)를 포함한다. b mRNA 준비를 위한 통합 “template‑in vaccines‑out”(템플릿‑인 백신‑아웃) 플랫폼의 액체 흐름도.

플랫폼 구조(Structure of the platform)

An integrated system was designed to realize automated 중합효소연쇄반응(PCR) 및 시험관 내 전사(IVT) for mRNA preparation. The prototype was designed using SolidWorks 3D software (Concord, USA), as shown in Fig. 2a. The main material used in this prototype was 알루미늄 합금, with some 3D-printed 부착물. The prototype was 62.5 cm × 50.0 cm × 32.5 cm. It contained four areas, as shown in Fig. 2b. The back area was designed for 전자 부품, including several 회로 and a 전원 공급 장치. The middle area was filled with seven 연동 펌프(peristaltic pump), two 5방 전자밸브(five-way electromagnetic valve), and four 3방 전자밸브(three-way electromagnetic valve) joined together by tubing (FEP, 1/16′′). The left side contained 11 저장소(reservoir) (nine 시약 저장소, one 플런저 펌프용 세척 저장소, and another 저장소 for 불필요한 폐기물). The front area was used for 중합효소연쇄반응(PCR) and 시험관 내 전사(IVT) reactions, and a 플런저 펌프(plunger pump) was used to mix the reaction 시약. The left and front areas were designed with a door made of 폴리메틸메타크릴레이트, which enables user-friendly implementation of the 중합효소연쇄반응(PCR) and 시험관 내 전사(IVT) steps. In addition, a 터치스크린이 장착된 마이크로컴퓨터 was placed on top of the whole device, through which users could customize their 워크플로우 and conduct experiments. The 핵심 구성 요소 of the platform are the 중합효소연쇄반응(PCR) 모듈 and HMM 모듈 for 중합효소연쇄반응(PCR) and 시험관 내 전사(IVT), respectively, which were both connected to three 제어 회로 and a 전원 공급 회로, as shown in Fig. S1.Fig. 2Structure of the prototype.a Overall view of the prototype, mainly including the 중합효소연쇄반응(PCR) 모듈, HMM 모듈, 플런저 펌프, and 저장소. b Structures inside the prototype, mainly including seven 연동 펌프(peristaltic pump), two 5방 전자밸브(five-way electromagnetic valve), and four 3방 전자밸브(three-way electromagnetic valve)

플랫폼은 밸브와 같은 구성 요소를 제어하기 위한 일련의 명령으로 구성된 맞춤형 사용자 전용 워크플로우 파일을 사용하였다. 워크플로우의 도입으로 플랫폼의 유연성, 다재다능성 및 이동성이 향상되었다. 이번 연구에서는 eGFP를 예시로 선택하여 Materials and Methods(재료 및 방법)에서 앞서 언급한 실험 세부 사항을 기반으로 워크플로우 파일 세트를 개발하였다. Figure S2는 워크플로우 편집을 위한 사용자 친화적 인터페이스를 보여준다. 이러한 워크플로우 파일은 순차적으로 플랫폼에 로드되었으며, 자동 반응은 액체 혼합물 추가 및 반응 튜브 교체와 같은 몇 가지 수동 개입으로 진행되었다. 새로운 mRNA 라운드를 준비하기 전에 프로토타입의 자체 테스트를 위해 “test” 파일이 로드되고, 튜빙은 “wash” 파일에 따라 한 번은 RNase ZAP으로, 이후 세 번은 DEPC 처리 물(0.1%)로 씻어 이전 실험에서 남은 잔류물 및 가능한 RNase를 제거하였다. 워크플로우 수행 중에는 실시간 온도가 도식 상단에 표시되고, 실행된 흐름은 회색으로 변하며 Figure S3에 나타난다. 전체 준비 과정에서 사용자는 반응 시약 및 완충액을 해당 저장소에 로드한 뒤 워크플로우 파일을 선택하고 “run” 버튼을 눌러야 한다. 특히, 이 플랫폼은 범용적이며 다른 여러 mRNA 제품을 생산하는 데에도 사용할 수 있다. 이 기사에서 사용된 워크플로우 파일은 Supporting Information(보조 정보)에 자세히 기술되어 있다.

PCR 모듈

플랫폼의 주요 구성 요소 중 하나는 그림 3a에 표시된 중합효소 연쇄반응(PCR) 모듈이다. 중합효소 연쇄반응(PCR) 모듈은 냉각 팬, 구리 합금 히트싱크, 펠티어 열전 냉각 효과 소자, PT-1000 온도 센서, 맞춤 설계된 절연 블록, 알루미늄 합금 튜브 받침대, 그리고 가열 뚜껑으로 구성된 지지 베이스로 이루어져 있다. 이 간단한 모듈은 시약에 대해 최대 가열 속도 1.8 °C/s(72–95 °C)와 냉각 속도 2.6 °C/s(95–58 °C)를 달성하여 빠른 온도 변화를 구현할 수 있다. 중합효소 연쇄반응(PCR) 온도 제어 전략은 튜브 받침대의 온도를 높거나 낮게 설정하여 액체 온도를 빠르게 변화시키는 “받침대 먼저, 액체 다음” 전략을 채택하였다. 반응액의 온도가 목표 온도에 거의 도달하면, 튜브 받침대의 온도를 목표 온도로 복원하고 PCR 동안 유지한다(그림 3b 참고). PCR 증폭 후, DNA 생성물은 1% 아가로스 TAE 겔 전기영동으로 정량적으로 평가되었다. 그림 3c에 나타난 바와 같이, PCR 모듈에서 얻은 DNA 생성물은 상용 PCR 기계(Bio‑Rad T100 Thermal Cycler)에서 얻은 것과 크기와 양이 유사하였다. 그림 3 PCR 모듈.a 냉각 팬, 히트싱크, 펠티어 열전 냉각 효과 소자, 절연 블록, 반응 튜브 및 가열 뚜껑을 포함한 PCR 모듈의 구조. b PCR(중합효소 연쇄반응) 실시간 온도 곡선(액체는 빨간색, 튜브 받침대는 초록색). c PCR 후 전기영동 이미지로, 샘플은 다음 순서대로 적재되었다: 마커, 표준 기계에서 얻은 PCR 생성물, 그리고 이 플랫폼에서 얻은 PCR 생성물.

HMM 모듈

플랫폼의 다른 핵심 구성 요소는 인비트로 전사(IVT)를 위한 HMM 모듈이며, 그림 4a에 표시되어 있다. HMM 모듈은 또한 냉각 팬, 구리 합금 히트싱크, 펠티어 열전 냉각 소자, PT-1000 온도 센서, 별도로 설계된 절연 블록, 알루미늄 합금 튜브 받침대로 구성된 지지 베이스를 가지고 있다. 주변을 감싸는 절연 블록은 반응 온도의 안정성을 보장할 수 있다. HMM 모듈은 인비트로 전사(IVT)를 위한 안정적인 온도 환경을 제공할 수 있으며, 30 °C에서 최대 온도 변동이 ±0.5 °C이다(그림 4b). 독립형 스테퍼 모터가 3D 프린트 쉘에 포함된 자석의 움직임을 제어한다. HMM 모듈은 자성 비드를 포함한 반응을 혼합하기 위해 플런저 펌프를 사용했으며, 단계, 속도, 간격 시간 및 루프로 구성된 최적화된 파라미터를 적용하였다. 그 후, 다량의 DNA 템플릿이 친수성 코팅된 스트레프타비딘 자성 비드에 포획되었고, 이후 mRNA 생성물은 올리고 d(T) 25 코팅 자성 비드에 포획되었다. 전통적인 진동 배양기는 지속적인 흔들림 반응 튜브에서 액체를 혼합하는데, 이는 번거로운 외부 하드웨어를 필요로 한다. 제안된 플랫폼은 대신 플런저 펌프를 채택하여 전체 프로토타입의 크기를 더욱 감소시켰다. 또한, 반응 혼합물 내의 자성 비드는 3D 프린트 쉘에 감싼 자석에 의해 90초 미만(그림 4c)에 모을 수 있다. 전기영동 이미지(그림 4d)는 상층액에 뚜렷한 밴드가 없음을 보여주며, HMM 모듈의 실용성을 나타낸다. DNA 템플릿이 포획된 후, 인비트로 전사(IVT) 반응 혼합물을 스트레프타비딘 자성 비드에 도입하고, 이어 DNA 소화, 전사체의 poly(A) 꼬리 변형 및 정제 과정을 수행하였다. 원하는 크기의 mRNA는 인비트로에서 합성·정제된 뒤 Agilent 2100 바이오분석기 시스템으로 정량화되었다. 그림 4e는 열 변성된 Agilent RNA 6000 ladder와 비교하여 인비트로에서 합성·정제된 세 가지 다른 배치의 mRNA를 보여주며, 수율은 각각 308 (1540 ng/μL), 198 (990 ng/μL), 324 (1620 ng/μL) μg이다. 참고로, Moderna mRNA-1273(코로나19용) 100 μg가 3상 무작위, 관찰자 눈가림, 위약 대조 시험³⁴에 사용되었다. 또한, Pfizer/BioNTech의 BNT162b2 30 μg가 안전성 및 효능을 평가하기 위한 3상 임상 시험에 사용되었다⁴³. 따라서, 플랫폼의 수율은 후보 mRNA 백신을 검증하는 세 번의 독립 실험에 충분했으며, 이는 실험실에서 임상으로의 새로운 mRNA 제품 개발 과정을 더욱 가속화할 수 있다. 그림 4 HMM 모듈.a HMM 모듈의 구조로, 냉각 팬, 히트싱크, 펠티어 열전 냉각 소자, 절연 블록, 그리고 독립형 스테퍼 모터에 의해 제어되는 3D 프린트 쉘에 포함된 자석을 포함한다. b 인비트로 전사(IVT) 모듈의 가열 안정성(30 °C에서 최대 온도 변동 ±0.5). c 3D 프린트 쉘에 감싼 자석에 의해 모아진 자성 비드의 사진(90초 미만). d 친수성 코팅된 스트레프타비딘 자성 비드에 의해 DNA 템플릿이 포획된 후의 전기영동 이미지로, 시료는 다음 순서로 적재되었다: 마커, PCR 생성물, 그리고 자성 비드 포획 후 상층액. e 인비트로에서 합성·정제된 세 배치의 mRNA가 열 변성된 Agilent RNA 6000 ladder와 비교하여 Agilent 2100 바이오분석기 시스템으로 정량화되었다

LNP 모듈 및 in vitro 형질전환

압력 컨트롤러, 흐름 모니터링 모듈, 그리고 SHM 마이크로플루이딕 칩(Fig. 5a)을 결합하여 LNPs^21,44를 생성하도록 설정하였다. 지질 벡터가 에탄올에 용해된 상태에서 핵산 용액과 1:3 비율(지질 벡터 300 μL/min, mRNA 백신 900 μL/min)로 혼합될 때 전기적 상호작용에 의해 LNP가 형성되었다. 생성된 LNP의 수소역학적 직경은 DLS로 분석되었으며, 평균 크기가 111.1 nm임을 확인하였다(Fig. 5b). 생성된 LNP의 형태는 TEM으로 확인하였다. Figure 5c는 LNP가 구형이며, 그 크기가 DLS 결과와 일치함을 보여준다. 이 결과는 지질 벡터와 mRNA로부터 안정적인 LNP를 형성할 수 있음을 확인시켜준다. 플랫폼에서 자동화된 준비 및 캡슐화 후, 제품의 품질은 HEK-293T 세포에 대한 트랜스펙션을 통해 추가 평가되었다. Figure 5d는 eGFP가 세포질에 성공적으로 발현되어, 형광 현미경 아래에서 양성 세포가 밝은 녹색 형광을 나타냄을 보여준다. 요약하면, 이 결과는 mRNA 백신 제조를 위한 시스템의 실용적 적용 가능성을 시사한다. Fig. 5 LNP 모듈 및 인 비트로 트랜스펙션.a 마이크로플루이딕 칩을 이용한 LNP 캡슐화 장치의 이미지로, 압력원, 두 개의 모니터링 모듈, 그리고 물 속 mRNA와 에탄올 속 지질 벡터용 두 개의 압력 컨트롤러를 포함한다. b DLS로 측정한 LNP의 크기 분포. c TEM으로 관찰한 LNP의 형태. 스케일 바, 100 nm. d 형광 현미경으로 촬영한 293T 세포 내 LNP 트랜스펙션. 스케일 바, 200 μm

SARS-CoV-2 RBD-mRNA 백신 생산에의 적용

이 플랫폼에서 확립된 워크플로 파일로 생산된 mRNA의 기능을 eGFP 발현으로 테스트한 후, 저자 그룹이 개발한 SARS-CoV-2 RBD-mRNA 백신을 이용해 이 플랫폼을 추가로 검증하였다⁴². Fig. 6a에 나타난 바와 같이, AUG로 시작하는 코딩 서열 영역은 SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 분리주(GenBank 접근 번호 NC_045512)의 스파이크 당단백질 유전자의 신호 서열(1–14 아미노산)과 RBD(319–541 아미노산)를 암호화한다⁴². Figure 6b는 표준 기계 또는 제안된 플랫폼의 중합효소연쇄반응(PCR) 모듈로 증폭된 RBD 템플릿의 전기영동 이미지와 수동 작업 또는 HMM 장치를 이용한 정제 후의 상등액을 보여준다. Fig. 6c에 나타난 바와 같이, 원하는 크기의 RBD-mRNA가 in vitro에서 합성·정제된 후 Agilent 2100 바이오애널라이저 시스템으로 정량화되었으며, 수율은 280 μg(1400 ng/μL)였다. 상업용 Precision Nanosystems Ignite(PNI)에서 생산된 mRNA-LNP가 표준 대조군으로 사용되었다. Fig. 6d에 나타난 바와 같이, 제안된 플랫폼과 PNI에서 제조된 mRNA-LNP의 단백질 발현 수준을 평가하였다. 웨스턴 블롯(Western blot) 밴드의 상대 밀도를 기준으로, 제안된 플랫폼에서 제조된 mRNA-LNP의 발현 수준은 상업용 장비의 약 70%에 해당함이 Fig. 6e에 나타난다. 이는 제안된 플랫폼에서 제조된 mRNA-LNP가 합리적인 단백질 발현 능력을 가지고 있음을 나타낸다. 향후 연구에서는 이 플랫폼의 효율성 향상에 중점을 둘 것이다.Fig. 6. SARS-CoV-2 RBD-mRNA 백신 생산에의 적용.a 최적화된 코돈으로 구성된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 신호 펩타이드(SP, 1–14 아미노산)와 수용체 결합 도메인(RBD, 319–541 아미노산)을 인코딩하는 SARS-CoV-2 RBD-mRNA 백신이 제작되었다. b RBD의 전기영동 이미지로, 시료는 다음 순서대로 적재되었다: 마커, 표준 기계에서 얻은 PCR 산물, 이 플랫폼에서 얻은 PCR 산물, 수동으로 자기 비드 포획 후 얻은 상등액, 플랫폼으로 자기 비드 포획 후 얻은 상등액. c 원하는 크기로 합성·정제된 RBD-mRNA가 Agilent 2100 바이오애널라이저 시스템으로 정량화되었다. d 웨스턴 블롯(Western blot) 분석 및 (E) 제안된 플랫폼에서 생산된 mRNA-LNP와 PNI가 제조한 mRNA-LNP의 24시간 전이 후 SARS-CoV-2 RBD 단백질 발현 평균 상대 밀도. PNI는 Precision Nanosystems Ignite의 약자이다. 평균 상대 밀도는 ImageJ 소프트웨어를 이용한 회색 분석으로 평가하였다.

결론

본 연구에서는 mRNA 제품의 효율적이고 주문형 제작을 위한 통합 제어 시스템을 갖춘 범용 통합 플랫폼을 제안하였다. 먼저 eGFP를 초기 예제로 사용하여 세척, 자체 테스트, 중합효소연쇄반응(PCR) 증폭, 캡핑을 포함한 in vitro 전사(IVT), DNA 소화, poly(A) 꼬리 추가 및 정제를 포함하는 일련의 워크플로 파일을 개발하였다. 그 후 통합 플랫폼을 이용해 eGFP mRNA의 생산 및 지질 나노입자(LNP) 캡슐화를 위한 PCR 및 IVT를 수행하였다. 또한 이 플랫폼으로 SARS-CoV-2 RBD-mRNA 백신을 생산했으며, 성공적인 단백질 발현은 시스템의 실용성을 입증하였다. 이러한 결과는 통합 및 자동화된 플랫폼이 다양한 서열의 mRNA 제품을 신속히 제작하도록 손쉽게 적용될 수 있음을 시사하며, 이는 mRNA 기술에 대한 폭넓은 접근성을 촉진하고 mRNA 제품 개발을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 긴급한 전염병 문제와 개인 맞춤 치료를 위한 후보 mRNA 백신을 빠르게 생성하고 초기 연구·개발 단계에서 짧은 시간 내에 테스트할 수 있다. 또한 제안된 플랫폼은 제조 전 과정을 아우르는 솔루션으로서 자원 제한 지역에서도 적용 가능하게 하여 새로운 mRNA 제품이 실험실에서 임상으로 전환되는 속도를 더욱 가속화할 수 있다.

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